Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области клеточной терапии, например, может ли трансплантация островка быть оптимизирована хирургическим методом hOMING? Основные преимущества этой техники в том, что она проста, быстра и настраивается, а проверка биоматериала также очень быстрая. Визуальная демонстрация размещения иглы имеет решающее значение для обеспечения надлежащей инъекции трансплантата внутри omentum, так как неправильно размещенная игла может привести к утечке островка.
Чтобы вызвать диабет, ввимите 75 миллиграммов на килограмм стрептозотоцина интраперитонически в каждый шестинедельный, от 150 до 190 граммов льюиса реципиента крысы, и проверить состояние диабета путем ежедневного измерения глюкозы в крови в течение первых четырех дней после инъекции. Когда крысы обладают гликемией более двух граммов на литр, подкожно вводят шесть единиц инсулина длительного действия в день, чтобы предотвратить осложнения диабета и потерю веса. Включите крыс в экспериментальную когорту, когда два измерения уровня глюкозы в крови хвостовой вены больше, чем от четырех до пяти граммов на литр в течение двух дней подряд, с уровнем C-пептида под 200 пикомолярных.
Для имплантации гранул, подтвердить отсутствие ответа на боль в крайнем случае в анестезии диабетической получателя животных и очистить шею с povidone йода. Бритье области имплантации и очистить открытые кожи с дополнительными povidone йода. Через три минуты, стерилизовать один 1 / 2 гранулы инсулина в один-пять раствора йода povidone и использовать 16 калибровочный трокар, чтобы проколоть открытые кожи шеи.
Затем используйте направляющий выступ и stylet для того чтобы вставить гранулы и шов отверстие с одиночным пунктом. Очистите стежок с большим содержанием йода povidone и позволить крысе восстановиться в клетке с мониторингом и пищей, чтобы избежать гипогликемии. Для измерения эффективности гранул, мера гликемии уменьшается каждую неделю в течение одного месяца после имплантации, в том числе крыс в экспериментальной когорте, когда мера уровня крови хвостовой вены C-пептид поддерживается под 200 пикомолярных через месяц после имплантации гранул инсулина.
Для заполнения внутриоментальных матричных островков подсчитайте количество островков, изолированных от здоровых крыс-доноров в островковых эквивалентах, и приготовьте один 7 660 островков эквивалент на килограмм реципиента в отдельных 1,5-миллилитровых трубках. Вымойте каждый aliquot с 500 микролитров среды CMRL без фетальной сыворотки крупного рогатого скота и повторное использование островковых гранул в 150 микролитров свежеприготовленного альгината гидрогеля перевозчика на трубку с тщательной смешивания перед размещением труб на льду. Далее загрузите одноми миллилитровые шприцы, оснащенные атрауматической иглой 21-го калибра со 150 микролитров пустого альгината без мертвого объема, а затем 150 микролитров альгината плюс островки.
Поместите шприцы на лед и подготовить шею первого животного получателя, как только что продемонстрировали. Используйте скальпель, чтобы сделать разрез над старой раны и использовать миппы, чтобы удалить гранулы. Закройте стежок одной или двумя одиночными точками стежка и поместите крысу в положение на спине.
Стерилизовать область брюшной полы и бриться. Используйте скальпель, чтобы создать 1 1 / 2 сантиметра лапаротомии только под грудиной. Поместите влажную стерилизованную марлю вокруг разреза и определите оментальную жировую прокладку, расположенную рядом с желудком.
Используйте типсы, чтобы аккуратно вытащить жировую прокладку из брюшной полости, распространяя ее на марлю. Гидрат оментальной ткани хорошо с двумя миллилитров предварительно нагревается, 37-градусный-Celsius стерильный солевой раствор, и, держа ткани с небольшими изогнутыми миппами в одной руке, проникают omental края между omental слоев с иглой островка загружен шприц с другой. При вставке иглы, убедитесь, что он окружен тонким слоем омментальной ткани перед началом инъекции.
Вставьте иглу полностью и медленно начать инъекционные островка подготовки при втягивания иглы, чтобы инъекционные островки, которые будут распространяться по всей ткани. Во время инъекции, втягивать иглу к краю тканей, останавливая инъекцию, когда игла почти из. Затем подождите пять секунд, прежде чем начать новую инъекцию в следующем месте.
И впрыснуть еще три-четыре aliquots, как попродемонстрировано. Когда все гидрогель был обойтись, снять иглу тщательно, чтобы избежать потери вводили островки, проверяя, что островки не сгруппированы в шприц в конце инъекции. Когда все островки были доставлены, увлажнить omentum и стенки лапаротомии, прежде чем тщательно вернуть омментальной ткани брюшной полости.
Введи два миллилитров предварительно разогретого стерильного солевого раствора в брюшную полость для регидратации крысы. Затем закройте мышечную стенку непрерывным швом нити и сшить кокечный слой одной точкой стежка. После одного-двух месяцев метаболического последующего, открыть хирургический разрез каждого получателя, как попродемонстрировано, и использовать миппы, чтобы тщательно распространить omenta на солевые пропитанные куски марли выложены рядом с разрезами.
Начиная с региона, придерживающихся хвоста поджелудочной железы, используйте ножницы, чтобы вырезать оментальной ткани и ввести два миллилитров предварительно разогретого солевого раствора перед закрытием каждого животного, как попродемонстрировано. Исправить извлеченные omenta в 4%paraformaldehyde перед встраиванием в парафин. Затем приобрети четырехмиметровые участки тканей на микротоме и нанесите гематоксилин и эозин пятно для морфологической оценки трансплантации.
Декстран бусы пересажены с помощью метода hOMING, как попродемонстрировано, часто наблюдались близко к кровеносным сосудам и были хорошо имплантированы в жировой ткани. В этом репрезентативном изогенном исследовании гликемия сначала контролировалась путем имплантации одного 1/2 гранул инсулина, как это было продемонстрировано, а затем имплантированными островками, о чем свидетельствует гликемия примерно два грамма на литр и C-пептидмия более 500 пикомоляров у животных-реципиентов. Кроме того, гистологический анализ эксплантированных оментов выявил высокореаскуляризованные островки, скорее всего, в результате их близости к кровеносным сосудам.
После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области клеточной терапии для изучения биоинженерных клеток микроокноронности в доклиниковых моделях.
