The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, "Artificial immune reactions," "Camelid antibodies," and "Antibody technologies." We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.

Balb / c oder NMRI - Mäuse (Mus musculus) aus unserer Brutkolonie an der Universität Potsdam (Potsdam, Deutschland) wurden für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern verwendet. Das Tier Arbeit wurde nach den einschlägigen nationalen und internationalen Richtlinien durchgeführt. Die Studie wurde von dem Brandenburger Ministerium für Umwelt, Gesundheit und Verbraucherschutz (Referenznummer V3-2347-A16-4-2012) zugelassen. 1. Herstellung von Immunkonjugaten <ol><li> Zur Kopplung des Antigens an einen Träger, verwenden Standard - Kopplungsprotokolle über amino-, Carboxy- oder Sulfo-Gruppen, wie zum Beispiel durch Glutaraldehyd, N - (3-dimethylaminopropyl) - N -ethylcarbodiimide (EDC) oder N - [y-Maleimidobutyryloxy ] succinimidester (sulfo-GMBS). </li><li> Zur Kopplung (beispielsweise mit Glutaraldehyd) 13 verwenden , das Zielprotein oder Peptid und dem Träger (Ovalbumin, Rinderserumalbumin oder keyhole limpet hemocyanin) in einem 1: 1 - Verhältnis. Verdünnen Sie die Ziel protein oder Peptid in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und das Trägerprotein in 50 mM NaHCO 3 -Puffer. Passen Sie die Lautstärke und die Konzentration auf die Menge, die für Immunisierungen. <ol><li> Das Vermischen der beiden Lösungen und fügen 1,25% Glutaraldehyd. Mischen und Inkubation der Probe für 4 Stunden bei Raumtemperatur (RT). Um die Hybridomzellen wählen, machen den gleichen Immunkonjugat, aber mit einem anderen Träger, um die Auswahl von unspezifischen Träger Bindemittel zu vermeiden. </li></ol></li><li> Dialysiere die Kupplung Probe durch eine schnelle Dialyse mit kommerziellen groben Harz durchführen (zB Sephadex G25). <ol><li> Perforieren den Boden einer 1,5-ml-Reaktionsgefäß mit einer Hohlnadel und legen Sie sie in einem Rohr 15 mL. Setzen Glaswolle in den Boden zum Abdichten und decken Sie es mit 300 mg groben Harz (bis zur Eichmarke von 0,5 ml). </li><li> Vorsichtig setzen 1 ml PBS tropfenweise in einem Reaktionsröhrchen 1,5 ml und stellen Sie sicher, dass die Glaswolle noch die Perforation dichtet. Lassen Sie das Grob Harz sgut und Zentrifuge die Säule bei 500 × g für 2 min. Eine solche Säule kann verwendet werden, 200 &amp; mgr; l des Kopplungsprobe dialysieren. Für größere Mengen, mehr Spalten machen. </li><li> Ändern Sie den Schlauch und legen Sie die Kupplungslösung auf den gequollenen groben Harz. Zentrifuge wieder bei 500 × g für 2 min. Entfernen Sie das Eluens aus der Tube und verwenden Sie es für die Immunisierung. </li></ol></li></ol> 2. Immunisierung von Tieren <ol><li> Wählen zwei oder drei 6- bis 12 Wochen alte Balb / c-Mäuse für die Immunisierung. </li><li> Für ein Tier, bereiten 150-200 ug des Immunkonjugat in 200 ul PBS und mischen Sie es mit 100 &amp; mgr; l der vollständigen Freund&#39;s Adjuvans (CFA). Mischen Sie die Lösung 3 mal mit einem kurzen und dünnen Nadel (0,6 mm Durchmesser) auf einer 1-ml-Spritze. Injizieren Sie die Lösung intraperitoneal in die Maus. </li><li> Geben Sie eine Booster-Injektion 6 Wochen später mit der gleichen Menge der Immunkonjugat, aber ohne CFA. Nehmen Sie Blut 7 Tage später zurück (aus dem retroorbitalen Sinus) und prepare Serum durch das Blut inkubiert wird für 3 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur (RT). <ol><li> Zentrifugieren der Mischung bei 3000 × g für 5 min. Nehmen Sie die Serumüberstand und gibt sie in eine neue Röhre. Bewahren Sie es bei -20 ° C. Entsorgen Sie das Pellet. </li></ol></li><li> Analysieren Sie den Seren über ELISA, wie in Schritt 3 beschrieben Für Fusion, wählen Sie die Maus mit dem höchsten Serumtiter. </li><li> In der Vorbereitung für die Zellfusion, erhöhen Sie die Maus mit 150-200 ug des Immunkonjugat in 300 &amp; mgr; l PBS ohne Adjuvans nur 4 Tage vor der Fusion. </li></ol> 3. ELISA <ol><li> Bereiten Sie eine Antigen-Lösung mit einer Konzentration von 5 ug / ml in PBS und Transfer 50 ul in jedes ELISA Vertiefung einer 96-Well-Platte. </li><li> Inkubieren der Platte für 2 h bei 37 ° C oder über Nacht bei 4 ° C in einer feuchten Kammer. </li><li> Waschen Sie die Platte 3-mal mit Leitungswasser. Blockieren die Vertiefungen mit 80 ul PBS / 5% Neugeborenenkälberserum (NCS) pro Vertiefung für 1 h bei RT in einer feuchten chBernstein. Bereiten Sie die Serumverdünnungen in einem 1: 5-Serie mit 01.50 beginnen. Für die Analyse der Zellkultur, verwenden Sie den unverdünnten Kulturüberstand. </li><li> Waschen Sie die Platte 3-mal mit Leitungswasser. Je 50 ul der Probe pro Vertiefung und in einer feuchten Kammer für 1 h bei RT inkubiert. Vorbereiten des sekundären Antikörperlösung in einer 1: 5000-Verdünnung eines Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase (HRP). </li><li> Waschen Sie die Platte 3-mal mit Leitungswasser und 50 &amp; mgr; l des sekundären Antikörperlösung pro Vertiefung. Inkubieren für 45 min bei RT in einer feuchten Kammer. </li><li> Eine frische Substratlösung. Machen Stammlösungen von 0,1 M NaH 2 PO 4 und 0,1% Wasserstoffperoxid. Nehmen Sie 5 Teile NaH 2 PO 4, 4 Teile Wasserstoffperoxid und 1 Teil Tetramethylbenzidin für die frische Substratlösung. <ol><li> Waschen Sie die Platte 10-mal mit Leitungswasser. Je 50 ml frisches Substratlösung in die Vertiefungen und Inkubation 5 - 10 min in derdunkel. </li></ol></li><li> Stoppen Sie die Reaktion mit 50 &amp; mgr; l 1 MH 2 SO 4 pro Vertiefung. Mit Hilfe eines Plattenlesegerät, messen die optische Dichte bei 450 nm mit einer Referenzwellenlänge von 630 nm. </li></ol> 4. Herstellung von Zellkulturen Myeloma <ol><li> Von nun an führen alle Arbeiten unter sterilen Bedingungen. </li><li> Bereiten Sie ein frisches Kulturmedium für die Zellkultivierung. Supplement 500 ml RPMI1640 mit 10% fötalem Kälberserum (50 ml), 2 mM L-Glutamin (5 ml) und 50 uM Mercaptoethanol (5 ml). Ersetzen Sie den Glutamin alle 7 Tage. </li><li> Tauen Sie ein Fläschchen mit murinen SP2 / 0-Zellen in warmem Wasser. Übertragung der Zelllösung in 10 ml frisches Kulturmedium und zentrifugieren für 10 min bei 200 x g. Überstand verwerfen und das Pellet in 1 ml frischem Kulturmedium. </li><li> Übertragen , um die Zellen in einem 25 cm 2 -Kolben und inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 in einem Inkubator. Erweitern Sie die Zellen auf zwei 75-m 2 Flaschen befErz-Fusion. Konservieren Aliquots für die Langzeitlagerung, wie in Schritt 7 beschrieben. </li></ol> 5. Herstellung von Feeder-Zellen <ol><li> Opfere eine 12 Wochen alte NMRI Maus (nach nationalen und institutionellen Richtlinien, zB durch CO 2 Inhalation). Entfernen Sie das Fell und reinigen Sie den Bauch mit 70% Ethanol. </li><li> Injizieren von 5 ml eiskaltem RPMI-Medium in den Bauch massieren den Bauch mit einer Pinzette und absaugen Feeder-Zellsuspension. Legen Sie die Zellen in einem leeren 50-ml-Röhrchen. Führen Sie diesen Schritt noch einmal. 7 bis 10 ml der Zellsuspension feeder sollte abgerufen werden. </li><li> Bereiten einen 100 ml-Feeder-Zellsuspension durch Zugabe von 90 mL Vollzellkulturmedium (RPMI 1640, 10% fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin und 50 uM Mercaptoethanol). Mischen Sie es und dann 100 &amp; mgr; l / Vertiefung in 10 x 96-Well-Zellkulturplatten. Inkubieren der Platten über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2 in einem Inkubator. </li></ol> 6. Zellfusion<ol><li> Sacrifice der immunisierten Maus durch Genickbruch oder CO 2 Inhalation und auszuschneiden die Milz 14. Nehmen zusätzliche Blut aus dem Herzen und bereiten die Serum, wie in Schritt 2.3 als Positivkontrolle im ELISA beschrieben. </li><li> Bereiten Sie eine Milz-Zellsuspension durch die Milz durch eine Zelle Sieb drücken. Füllen Sie bis zu 20 ml mit Vollzellkulturmedium. Ernte der Zellen in 50-ml-Röhrchen durch Zentrifugation (200 xg, 10 min und 4 ° C). Überstand verwerfen. </li><li> Spülen der Zellkulturflasche und Ernte der myeloma Zellen durch Zentrifugation (200 xg, 10 min und 4 ° C) und den Überstand zu verwerfen. </li><li> Resuspension der Zellpellets in 20 ml balanced salt Puffer (BSS) (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 4 mM CaCl 2, 2,5 mM MgCl 2 und 5 mM Tris-HCl; pH 7,4) und erneut zentrifugieren. Wiederholen der Waschschritte dreimal. </li><li> Zur Einstellung des Splenozyten-: Myelom-Zellverhältnis, zählen die Zellen nach dem zweiten Waschschritt durch Tannest Resuspendieren des Pellets in 1 ml BSS-Puffer. Machen Sie eine Verdünnung von 1:10 und Transfer 10 ul in eine Zelle Zählkammer. Zählen Sie die Zellen und bestimmen die Zellkonzentration in 1 ml. </li><li> Stellen Sie die Zellzahlen in den BSS-Puffer bis drei Teilen Splenozyten und einteiliger Myelomzellen in einem 1 ml Endvolumen. Nehmen Sie 200 ul der Zellsuspension und mischen Sie es mit 200 ul PEG8000 (1 g in 4 ml BSS-Puffer). Übertragen Sie die 400 &amp; mgr; l in eine Elektroporationsküvette mit einem Durchmesser von 2 mm und stellen Sie den Puls (600-650 V und 25 ms). <ol><li> Nach dem Puls der Zellen bei RT für 3 min in der Küvette inkubiert. Entfernen Sie die Zellen und legte sie tropfenweise in einen Erlenmeyerkolben mit 100 ml HAT-Medium (RPMI 1640, 10% FCS, 2 mM Glutamin, 50 uM Mercaptoethanol, 100 uM Hypoxanthin, 5,8 uM Azaserin und 16 uM Thymidin). </li><li> Wiederholen Sie die Fusion 4-mal, bis die 1-ml-Charge ausgegeben wird. Inkubieren den Erlenmeyerkolben für 3 h bei 37 ° C und 5% CO 2in einem Inkubator. </li></ol></li><li> Ergänzen Sie die Zellsuspension erneut mit Hypoxanthin, Azaserin und Thymidin, bevor sie die Zellen auf den Feeder-Layer-Beschichtung. Füge 100 &amp; mgr; l der Zellsuspension pro Vertiefung auf die Feeder - Schicht - Platten und Inkubation der Platten bei 37 ° C und 5% CO 2 (in einem Inkubator). Die endgültige Konzentration innerhalb des Bohrlochs sollte 100 uM Hypoxanthin, 5,8 uM Azaserin und 16 uM Thymidin sein. </li><li> Durchführen einer mikroskopischen Untersuchung (Vergrßerung: 10fach Objektivlinse, 10X Okular) für klonale Wachstum in jeder Vertiefung der Platte nach 7 Tagen, um zu bestimmen, ob die Vertiefungen mono- oder polyklonalen sind. Monoklonale Zellen sind eine Gruppe von Zellen, die aus einer einzigen Zelle stammen. Polyklonalen Zellen sind mehrere Cluster von Zellen in einem gut. Ändern Sie den kompletten Medien nach 7 Tagen und Inkubation wieder für 7 Tage im HAT-Medium. </li><li> Ändern Sie das HAT-Medium und pflegen die Zellen in Vollzellkulturmedium. Verwenden Sie den Überstand eine E auszuführenLISA, wie in Schritt 3. Positive Hybridomzellen beschrieben müssen in 24-Well-Platten expandiert werden nach den Tests für die Produktion von spezifischen Antikörpern. Wenn die Zellen polyklonal sind, hat eine begrenzte Verdünnung durchgeführt werden (beschrieben in Stufe 8). </li></ol> 7. Kryokonservierung von Hybridome <ol><li> Cryoconserve positive mono- und polyklonalen Hybridome für die Langzeitlagerung. Ernte der Zellen aus einer 24-Well-Platte mit einer Konfluenz von&gt; 60% durch Zentrifugation (200 xg, 10 min und 4 ° C). </li><li> Das Pellet in 500 &amp; mgr; l Vollzellkulturmedien und gibt sie in eine Kryoröhrchen. In 500 &amp; mgr; l Gefriermedium (RPMI 1640, 20% FCS und 15% Dimethylsulfoxid), mischen Sie es und steckte es in eine Styropor-Box oder einem speziellen Gefrierkasten. Bei -80 ° C für 3 Tage. Nach 3 Tagen kann die Kryoröhrchen für langfristige Lagerung in flüssigen Stickstoff überführt werden. </li></ol> 8. Begrenzung Verdünnung von polyklonalen Hybridome <ol><li> Makea feeder layer Kultur, wie 5. Ernte positive polyklonale Zellen in Schritt beschrieben ist, wie in Schritt 7.1 beschrieben. Zählen Sie die Zellen, wie in Schritt 6.5, und stellen Sie die Zellzahl auf 10 Zellen / ml, mit einem Endvolumen von 10 ml für eine 96-Well-Platte. 100 l / Vertiefung auf die Feeder-Schicht. </li><li> Inkubieren für 7 Tage bei 37 ° C und analysieren die Klonwachstum mikroskopisch (Vergrößerung: 10x Objektivlinse, 10x Okular). Machen Sie einen ELISA von dem Kulturüberstand, wie in Schritt 3 beschrieben, und identifizieren die geeigneten monoklonalen Hybridome für die Massenkultur. </li></ol> 9. Massenkultur und Aufreinigung von monoklonalen Antikörpern <ol><li> Übertragung der monoklonalen Hybridome mit den entsprechenden ELISA - Signale bis 25 cm 2 oder 75 cm 2 -Kolben und sammeln , um 500 ml des Kulturüberstand auf. Testen Sie die Kultur wöchentlich für spezifische Antikörperproduktion und zur Erhaltung 3-5 Aliquots pro Hybridom für die Langzeitlagerung, wie in Schritt 7 beschrieben. </li><li&gt; Centrifuge der Kulturüberstand bei 4.900 xg und 4 ° C für 15 min und durch ein 0,45-um-Filter gefiltert werden. Mischen Sie den Überstand mit Bindungspuffer (4 M NaCl und 2 M Glycin-NaOH, pH 8,9) in einem 3: 1-Verhältnis. </li><li> Bereiten Sie eine Protein - A - Säule durch Waschen mit Waschpuffer (verdünnt den Bindungspuffer 1: 3 in dH 2 O). Führen Sie den Überstand von Schritt 9.2 über die Säule und sammeln den Durchfluss. Eluieren des gebundenen Antikörpers mit 0,1 M Citrat, pH 3,5, und neutralisiert den pH-Wert sofort mit 500 ul Tris-HCl, pH 9,0. </li><li> Charakterisieren der eluierten Antikörper durch SDS-PAGE, Western Blot und ELISA, und bestätigen Sie für die endgültige Anwendung. <ol><li> Für die SDS-PAGE, nehmen Sie 3 bis 5 ug gereinigte Antikörperlösung pro Spur (eine 20-ul-Probe), 5 ul 4x SDS-Probenladepuffer hinzufügen (8% SDS, 20% 2-Mercaptoethanol, 40% Glycerin und 0,015 % Bromphenol, reduziert) und erhitzt die Sonden bei 95 ° C für 5 min. Als Kontrolle verwenden die gleiche Probe mit einer gereinigten antibody des gleichen Isotyps, aber irrelevanter Spezifität. </li><li> Legen Sie die Proben auf einem 12,5% SDS-Gel, legen 5 ul einer ungefärbten Protein Leiter in einer zusätzlichen Spur, und trennen Sie diese durch Elektrophorese. Stain das Gel mit Coomassie Brilliant Blue und dokumentieren die Ergebnisse. Eine grundlegende SDS - Protokoll wurde im Jahr 1970 15 von Laemmli etabliert. </li></ol></li></ol>

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The authors Pamela Holzl&#246;hner and Katja Hanack are the co-founders of new/era/mabs GmbH, a company that offers the customized generation of monoclonal antibodies.

Die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern von Hybridoma-Technologie erfordert eine intensive und ausführliche Epitop-Analyse, insbesondere im Hinblick auf die endgültige Anwendung, wenn der Antikörper das Ziel erkennen sollte. Dies wird oft von den Benutzern unterschätzt und führt zu Antikörpern mit schwachen Leistungen. Der Fusionsprozess ist immer zufällig, was bedeutet, dass das Ergebnis der spezifischen Hybridomen auf das Zellverhältnis in hohem Maße abhängig ist und die Vitalität an dieser Stelle. Nach...

Die Hybridom - Technologie in diesem Protokoll vorgestellt wurde zuerst von Köhler und Milstein 1 1975 beschrieben und mit Ausnahme von einigen technischen Verbesserungen hat die Hauptprozedur nicht dramatisch während der letzten 40 Jahre 2 geändert. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine geeignetere Immunisierungsstrategie, eine Standardmethode zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern, und ein Beispiel für eine Validierungsmethode (ELISA) zu erklären. Antikörper sind unglaubliche Werkzeuge und tragen zu einer breiten Palette von technologischen Ansätzen, wie Durchflusszytometrie, magnetische Zellsortierung oder Immun sowie zu diagnostischen und therapeutischen Möglichkeiten für die Überwachung der Krankheiten und Behandlung 3. Die kommerzielle Verfügbarkeit von monoklonalen Antikörpern für die gewünschten Ziele wird durch die Anwesenheit von mehr als 24 verschiedenen Web - Datenbanken mit fast unzähligen Mengen von Antikörpern oder Antikörper-verwandte Produkte 4 gezeigt. Im Jahr 2015 einntibody Moleküle waren Teil einer internationalen Diskussion 5-7 aufgrund schwerwiegender Probleme in der richtigen Validierung und Charakterisierung von im Handel erhältlichen Antikörpern. Es kann schwierig und teuer sein, um spezifische Antikörper für eine gezielte Antigen zu finden, und oft haben sie nicht die Affinität oder Spezifität benötigt. Obwohl einen Antikörper zu erzeugen ist immer noch zeitaufwendig und erfordert qualifiziertes Personal um den Antikörper zu entwickeln und zu validieren, einen Antikörper einzeln produzieren könnte besser als ein Kauf. Aufgrund der Tatsache, dass die Antikörperproduktion ist zeitaufwendig und erfordert Erfahrung, alternative Verfahren zur Herstellung von Bindungsmolekülen wurden entwickelt, um diese Probleme zu überwinden. Die am häufigsten verwendete alternative Methode ist die rekombinante Herstellung von einkettigen Antikörpern mittels Phagen-Display. Die Gene für die variable Bindungsregion aus Zellen und in Kombination mit dem Beschichtungsprotein eines Phagen extrahiert. Die single Kette wird dann auf der Oberfläche eines Bakteriophagen exprimiert und in mehreren Schritten Panning 8 gescreent. Die Herstellung von Einzelketten-Antikörper ist ein bisschen schneller, aber es erfordert auch ein erfahrener Experimentator. Die Nachteile einiger rekombinanter Einketten-Antikörper sind schlechte Stabilität und fehlende Eignung für die in vitro Diagnostik. In den meisten diagnostischen Tests, ein Fc-Rezeptor für die Detektion erforderlich ist, die anschließend zu einem rekombinanten Einketten-Antikörper zugegeben werden muss. Auch dies ist zeitaufwendig und sogar noch komplexer ist als die Hybridom-Technik. In In - vitro - Diagnostik, wurden in voller Länge monoklonalen Maus und Kaninchen - Antikörper zeigte die beste Wahl zu sein. Einer der wichtigsten Schritte in der Herstellung monoklonaler Antikörper erzeugen, muss getan werden, bevor die Arbeit im Labor beginnt: das Design der Immunkonjugat. Fragen, die gelöst werden müssen, sind: Was ist die physikalische Zusammensetzung des Targets in der letzten applicat istIon, und die Matrizen vorhanden sind? Welche Konzentration wird das Ziel in der Anwendung? Was ist die letzte Anwendung, und was sind die Voraussetzungen, dass der Antikörper erfüllen muss? immer berücksichtigen, dass, wenn ein lineares Peptidfragment verwendet wird, ist es auch in der endgültigen Epitop in der Zielwahl linear zu sein hat; andernfalls, binden die Antikörper nicht. Natürlich unabhängig von der Durchmusterungsverfahren, unterschiedliche antigenische Formate in verschiedenen Anwendungen zu erkennen Antikörper könnten ausgewählt werden, aber dies muss sehr genau überprüft werden. Dies sind die Gründe, warum der Antikörperentwicklung und Validierung sind solche ehrgeizigen Prozesse. Die Wahl des Antigen-Format für die Immunisierung ist von grundlegender Bedeutung für die Entwicklung von Antikörpern und bestimmt den Erfolg oder das Scheitern dieses Prozesses. Nachdem die Mäuse einen entsprechenden Antikörpertiter exprimieren, werden die Milzzellen isoliert und mit Myelomzellen fusioniert. Die am häufigsten verwendeten Myelom-Zelllinienmurinen monoklonalen Antikörper Entwicklung sind X63-Ag 8.653 9 und Sp2 / 0-Ag 14 10 von einer Balb / c - Maus - Stamm. Die Zellen stammen von einem bösartigen B-Zell-Lymphom und wurden ausgewählt, weil sie alle ihre eigenen schweren oder leichten Ketten nicht absondern. 1 (Splenozyten gegen Myelomzellen): Die Zellen können zwischen 1:10 und 10 bis zu einem Verhältnis angepasst werden. 1 und verschmolzenen durch Polyethylenglykol (PEG) und Elektrofusion , gemäß Stoicheva und Hui 11: In diesem Protokoll wurden die Zellen in einem Verhältnis von 3 angepasst. Die Fusion von B-Zellen und Myelomzellen ist ein Zufallsprozess. Daher Hybride von zwei B-Lymphozyten oder zwei Myelomzellen könnten erzeugt werden, aber diejenigen Hybride würde nicht für eine lange Zeit in Kultur überleben können. Die Zellen werden einer Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT) Auswahl, nach dem nur fusionierten Hybridomzellen aufgrund der Möglichkeit der Verwendung der de novo - Weg der Pyrimidinsynthese überleben kann. Für die Erzeugung von monoclonal Antikörper ist es notwendig, eine Zelllinie Ursprung von einer Mutterzelle zu erhalten. Die Monoklonalität wird sichergestellt durch die Verdünnungstechniken begrenzen und die mikroskopische Analyse des Zellwachstums. Die Hybridom-Kulturüberstände werden auf spezifische Antikörperproduktion, meist durch ELISA gescreent oder Durchflusszytometrie, und die besten Bindemittel ausgewählt. Nach der Massenkultur und Reinigung kann schließlich das Antikörpermolekül charakterisiert und für die gewünschte Anwendung validiert werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">glutaraldehyde</td>
			<td style="width:81px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">G5882</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC)</td>
			<td style="width:81px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">39391-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sulfo-GMBS</td>
			<td style="width:81px;">Perbio Science Germany</td>
			<td style="width:136px;">22324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">ovalbumin</td>
			<td style="width:81px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A5503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:81px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">keyhole limpet hemocyanin</td>
			<td style="width:81px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">H8283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">Falcon tubes 15 mL</td>
			<td style="width:81px;">Biochrom GmbH</td>
			<td style="width:136px;">P91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">reaction vials, 1.5 mL</td>
			<td style="width:81px;">Carl Roth GmbH &#38; C0.KG</td>
			<td style="width:136px;">CNT2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">hollow needle</td>
			<td style="width:81px;">Carl Roth GmbH &#38; C0.KG</td>
			<td style="width:136px;">C724.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">glass wool</td>
			<td style="width:81px;">Carl Roth GmbH &#38; C0.KG</td>
			<td style="width:136px;">6574.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">Sephadex G25 coarse</td>
			<td style="width:81px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">GE-17-0034-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">Freund&#180;s adjuvant, complete</td>
			<td style="width:81px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">F5881-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">ELISA plates, 96 well</td>
			<td style="width:81px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:136px;">655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">neonatal calf serum</td>
			<td style="width:81px;">Biochrom GmbH</td>
			<td style="width:136px;">S1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:247px;">TipOne Tips 1000 &#181;L</td>
			<td style="width:81px;">Starlab</td>
			<td style="width:136px;">S1111-2021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">Pipette tips 200 &#181;L</td>
			<td style="width:81px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:136px;">739291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td style="width:81px;">Dianova</td>
			<td style="width:136px;">115-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">tetramethylbenzidine</td>
			<td style="width:81px;">Carl Roth GmbH &#38; C0.KG</td>
			<td style="width:136px;">6350.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Natriumdihydrogenphosphat</td>
			<td style="width:81px;">Carl Roth GmbH &#38; C0.KG</td>
			<td style="width:136px;">K300.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:247px;">peroxide/urea</td>
			<td style="width:81px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">sulphuric acid</td>
			<td style="width:81px;">Carl Roth GmbH &#38; C0.KG</td>
			<td style="width:136px;">4623.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:81px;">Life technologies GmbH</td>
			<td style="width:136px;">31870074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:81px;">Carl Roth GmbH &#38; C0.KG</td>
			<td style="width:136px;">HN08.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:81px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:247px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:81px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">TC-flask 25 cm2</td>
			<td style="width:81px;">Peske GmbH</td>
			<td style="width:136px;">86-V025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">TC-flask 75 cm2</td>
			<td style="width:81px;">Peske GmbH</td>
			<td style="width:136px;">86-V075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">ethanol, 96%</td>
			<td style="width:81px;">Carl Roth GmbH &#38; C0.KG</td>
			<td style="width:136px;">P075.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">cell strainer</td>
			<td style="width:81px;">VWR international</td>
			<td style="width:136px;">734-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">Falcon tubes 50 mL</td>
			<td style="width:81px;">Biochrom GmbH</td>
			<td style="width:136px;">P91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">PEG 8000</td>
			<td style="width:81px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">1546605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="97">
			<td height="97" style="height:97px;width:247px;">electroporation cuvette, 2mm</td>
			<td style="width:81px;">Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K.</td>
			<td style="width:136px;">EKL2,25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">hypoxanthine</td>
			<td style="width:81px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">H9636-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">azaserine</td>
			<td style="width:81px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">thymidine</td>
			<td style="width:81px;">USB Europa GmbH</td>
			<td style="width:136px;">22305 1 GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">TC-plates 96 well</td>
			<td style="width:81px;">Biochrom GmbH</td>
			<td style="width:136px;">P92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">TC-plates 24 well</td>
			<td style="width:81px;">Biochrom GmbH</td>
			<td style="width:136px;">P92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">cryotubes, 1mL</td>
			<td style="width:81px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">V7384-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">dimethylsulfoxid</td>
			<td style="width:81px;">Carl Roth GmbH &#38; C0.KG</td>
			<td style="width:136px;">4720.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">protein A sepharose</td>
			<td style="width:81px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P3391-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">SDS sample loading buffer, Roti-Load 1</td>
			<td style="width:81px;">Carl Roth GmbH &#38; C0.KG</td>
			<td style="width:136px;">K929.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">unstained protein ladder</td>
			<td style="width:81px;">BioRad Laboratories</td>
			<td style="width:136px;">161-0363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">comassie brilliant blue R-250</td>
			<td style="width:81px;">BioRad Laboratories</td>
			<td style="width:136px;">161-0406</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of murine monoclonal antibodies by hybridoma technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

1 zeigt ein Beispiel für den Antigen-spezifischen Serumtiter für eine Immunisierung im Labor durchgeführt. 5.000.000 im Vergleich zu einem Serum eines naiven Maus: In dieser Figur wurden die Immunseren A und B von 1:50 bis 1 titriert. Das Antigen wurde auf der festen Phase beschichtet ist, und die spezifischen Antikörper wurden mit einem POD-konjugiertes Ziege-anti-Maus-Ig-Antikörper nachgewiesen. Beide Seren der immunisierten Mäuse zeigten eine signifikant höhere...

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Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridomtechnologie

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

41.1K Aufrufe.  University of Potsdam. An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening. 

Serie: Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating histoplasmosis caused by the fungus Histoplasma capsulatum and 2) to examine the role of virulence factors as target for therapy. To generate mAbs, mice are immunized, the immune responses are assessed using a solid phase ELISA system developed in our laboratory, and the best responder mice are selected for isolation of splenocytes for fusion with hybridoma cells. C57BL/6 mice have been extensively used to study H. capsulatum pathogenesis and provide the best model for obtaining the data required. In order to assess the role of the mAbs in infection, mice are intraperitoneally administered with either mAb to H. capsulatum or isotype matched control mAb and then infected by either intravenous (i.v.), intraperitoneal (i.p.), or intranasal (i.n.) routes. In the scientific literature, efficacy of mAbs for fungal infections in mice relies on mortality as an end point, in conjunction with colony formin units (CFU) assessments at earlier time points. Survival (time to death) studies are necessary as they best represent human disease. Thus, efficacy of our intervention would not adequately be established without survival curves. This is also true for establishing efficacy of vaccine or testing of mutants for virulence. With histoplasmosis, the mice often go from being energetic to dead over several hours. The capacity of an intervention such as the administration of a mAb may initially protect an animal from disease, but the disease can relapse which would not be realized in short CFU experiments. In addition to survival and fungal burden assays, we examine the inflammatory responses to infection (histology, cellular recruitment, cytokine responses). For survival/time to death experiments, the mice are infected and monitored at least twice daily for signs of morbidity. To assess fungal burden, histopathology, and cytokine responses, the mice are euthanized at various times after infection. Animal experiments are performed according to the guidelines of the Institute for Animal Studies of the Albert Einstein College of Medicine.

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

C57BL/6 mice have been used to study Hc pathogenesis and provide the best model. We are exploring the potential benefits of humoral immunity against this fungus and generated several mAbs [to histone H2B and a heat shock protein 60kDa] that we tested for their protective efficacy after intraperitoneal administration.

Passive Verwaltung von monoklonalen Antikörpern gegen H. capsulatum Ua Pilzpathogene

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

Erzeugung und Kennzeichnung von Murine Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen mit Qdot Nanokristalle für Tracking-Studien

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

Hens can be immunized by means of i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume 0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun plasmid-immunization. Dependent on the immunogenicity of the antigen, high antibody-titres (up to 1:100,000 - 1:1,000,000) can be achieved after only one or 3 - 4 boost immunizations. Normally, a hen lays eggs continuously for about 72 weeks, thereafter the laying capacity decreases. This protocol describes the extraction of total IgY from egg yolk by means of a precipitation procedure (PEG. Polson et al. 1980). The method involves two important steps. The first one is the removal of lipids and the second is the precipitation of total IgY from the supernatant of step one. After dialysis against a buffer (normally PBS) the IgY-extract can be stored at -20&deg;C for more than a year. The purity of the extract is around 80 %, the total IgY per egg varies from 40-80 mg, dependent on the age of the laying hen. The total IgY content increases with the age of the hen from around 40 mg/egg up to 80 mg/egg (concerning PEG precipitation). The laying capacity of a hen per year is around 325 eggs. That means a total potential harvest of 20 g total IgY/year based on a mean IgY content of 60 mg total IgY/egg (see Table 1).

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

This protocol describes in particular the extraction of total IgY from egg yolk by means of polyethylene glycol precipitation and gives general information about IgY technology.

IgY-Technologie: Extraction of Chicken Antikörper aus Eidotter durch Polyethylenglykol (PEG) Niederschlag

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

Nachweis des invasiven Pulmonale Aspergillose bei malignen hämatologischen Patienten mit Lateral-Flow-Technologie

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Erzeugung von rekombinanten humanen IgG monoklonalen Antikörpern aus Immortalisierte Sortiert B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

Generation von Escape Varianten des Influenza-Virus Monoclonal Antikörper neutralisieren

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

Eine Methode zur Bewertung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Influenza Hämagglutinin spezifische Antikörper induziert

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

Generierung von monoklonalen Antikörpern gegen Naturprodukte

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for vaccination as well as understand how pathogenic antibody responses develop in allergies and autoimmune disease. Generating robust antigen-specific antibody responses is not always trivial. In mouse models, it often requires multiple rounds of immunizations with adjuvant that leads to a great deal of variability in the levels of induced antibodies. One example is in mouse models of peanut allergies where more robust and reproducible models that minimize mouse numbers and the use of adjuvant would be beneficial. Presented here is a highly reproducible mouse model of peanut allergy anaphylaxis. This new model relies on two key factors: (1) antigen-specific splenocytes are adoptively transferred from a peanut-sensitized mouse into a na&#239;ve recipient mouse, normalizing the number of antigen-specific memory B- and T-cells across a large number of mice; and (2) recipient mice are subsequently boosted with a strong multivalent immunogen in the form of liposomal nanoparticles displaying the major peanut allergen (Ara h 2). The major advantage of this model is its reproducibility, which ultimately lowers the number of animals used in each study, while minimizing the number of animals receiving multiple injections of adjuvant. The modular assembly of these immunogenic liposomes provides relatively facile adaptability to other allergic or autoimmune models that involve pathogenic antibodies.

Described is the preparation of antigenic liposomal nanoparticles and their use in stimulating B-cell activation in vitro and in vivo. Consistent and robust antibody responses led to the development of a new peanut allergy model. The protocol for generating antigenic liposomes can be extended to different antigens and immunization models.

Antigenen Liposomen für Generation krankheitsspezifische Antikörper

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...