PO1 HL55798 (bis KL) und American Heart Association Scientist Development Grant 0525532U (zum EG): Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewähren unterstützt.

1. Isolierung von murinen Aorten Institutionelle IACUC Ausschuss Zulassung des Verfahrens ist erforderlich, um mit Mäusen arbeiten. <ol><li> Bereiten heparinzed PBS durch Zugabe von 1000 Einheiten Heparin-Natrium und 50 ml PBS und Umdrehen des Röhrchens mischen. Bereiten Sie eine leere Auflistung Rohr für das Blut und eine Sammlung Röhrchen mit PBS für jeden Aorta gesammelt werden. Bewahren Sie alle Röhrchen auf Eis. </li><li> Heparinisierung eine Spritze zur Blutabnahme (0,1 von 1000 U / ml Heparin-Natrium), bereiten chirurgische Instrumente (zwei Paar gebogene Pinzette, ein Paar Präparierschere, und ein Paar microshears) und ein Sezieren Bühne für die Dissektion. </li><li> Euthanize eine Maus mit Kohlendioxid in einer zugelassenen Kammer folgende NIH and Institutional IACUC Ausschuss Richtlinien bezüglich Nagetier Euthanasie. Überprüfen Sie für die Wirksamkeit vor der Übertragung der Maus an die Zerlegung der Bühne. </li><li> Kurz einweichen der Maus mit 70% Ethanol und ziehen Sie die Maus, um die Dissektion der Bühne. Zeichnen Sie das Blut aus der Maus über Herzpunktion. </li><li> Öffnen Sie die Bauch-und Brusthöhle. Mit einer 10 ml Spritze mit einer 25 g Nadel komplett versorgen die Gefäße mit PBS mit 2% von Heparin vollständig zu entfernen Blut aus den Gefäßen durch Herzpunktion. Stellen Sie sicher, dass es kein Blut in der Aorta Gewebe. Die Perfusion sollte langsam mit wenig Druck, um sicherzustellen, dass alle Plaques in der Gefäßwand intakt bleiben durchgeführt werden. </li><li> Sezieren und entfernen Sie die inneren Organe, urogenitalen Organe, Zwerchfell und Milz, so dass die Nieren, Herz und Aorta intakt. </li><li> Sorgfältig sezieren Fettgewebe und paraaortale Lymphknoten entfernt von der Aorta, so dass die Aorta und Adventitia intakt. Sammeln Sie die ganze Aorta einschließlich Aortenbogen, aufsteigend, absteigend, Thorax-und Bauch-Portionen. Legen Sie die isolierten Aorta in ein Sammelrohr mit PBS. Während der Isolierung, versuchen, das Schiff feucht zu halten. </li></ol> 2. Vorbereitung der einzelnen Zellsuspensionen <ol><li> Erstellen Sie eine 1X Aorta Dissoziation Enzyme Stammlösung (ADES) (125 U / ml Collagenase Typ XI, 60 U / ml Hyaluronidase Typ 1-s, 60 U / ml DNase I und 450 U / ml Collagenase Typ I, in 2,5 ml PBS, aus Galkina et al geändert. 7). Alle Enzyme sind von Sigma-Aldrich. Legen Sie die Lager Enzymlösung auf Eis. </li><li> Entfernen Sie das PBS aus der Sammlung Röhrchen mit der Aorta. Fügen Sie 2,5 ml 1X ADES jedem Aorta. Schneiden Sie die Aorten in kleine Stücke, um enzymatische Verdauung zu erleichtern oder lassen Sie die ganze Aorta intakt. Inkubieren Sie die Aorten mit dem 1X Enzym-Lösung für 1 Stunde bei 37 ° C (langsamere Schütteln ist optional). </li><li> Nach dem 1 Stunde Inkubation, bereiten einzelne Zellsuspensionen aus der verdauten Aorta durch Scherung der Aorten auseinander und indem sie durch einen 70 um Zellsieb in 5ml Polypropylen FACS-Röhrchen (BD Falcon). Pellet die Zellen durch Zentrifugation (400xg, 5 Minuten, 4 ° C). </li><li> Resuspendieren der Zellen in 1 ml FACS-Puffer (PBS mit 1% BSA und 0,05% NaN 3 ergänzt) und bestimmen, wie viele Zellen vorhanden sind, in der Aorta Zellsuspension mit Trypanblau, eine Zählkammer und einem Lichtmikroskop. Die Gesamtzahl der Zellen nach dem Aufschluss erhalten auf Maus Alter und Ernährung oder die Schwere der Atherosklerose ab. </li></ol> 3. Durchflusszytometrie-Färbung <ol><li> Label eine entsprechende Anzahl von neuen FACS-Röhrchen. Im Allgemeinen sollte der Durchflusszytometrie Experimente haben eine nicht-gefärbten Steuerrohr, der einzigen Farbe Rohre, entsprechende Fluoreszenz-minus-eins-Kontrollen (FMO) 8, entsprechende Isotypkontrollen, und eine Reihe von experimentellen Rohre gesetzt. Da es eine begrenzte Anzahl von Aorten-Leukozyten, die isoliert werden können, können Milz Leukozyten verwendet, um einzelne Kontrollfärbung durchzuführen. </li><li> Wir verwenden eine Standard-Durchflusszytometrie Protokoll Aorta Zellsuspensionen Fleck. Kurz gesagt, Transfer ein Aliquot von 0,5-1x10 6 Zellen aus einem Aorten-Zellsuspension in ein FACS-Röhrchen (s). Add 1 ml FACS-Puffer-und Pellet die Zellen durch Zentrifugation. Entfernen Sie den Überstand von den pelletierten Zellen durch Dekantieren. </li><li> Bereiten Fc-Block-Lösung und Antikörper-Cocktails für die experimentelle Röhren-, Fluoreszenz-minus-eins-Rohre und Röhren Isotyp. Add 100 &amp;mgr; des Fc-Block in FACS-Puffer (14.2μg/ml, Klon 2.4G2), alle Rohre und Finger Flick oder vorsichtig vortexen, um die Zellen zu resuspendieren. Inkubieren Sie die Proben für 15-20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Antikörper-Färbung, Isotyp-Färbung oder FMO Kontrollfärbung Cocktails. Bestimmen Sie die optimale Konzentration von Antikörpern in Ihren vorläufigen Titrationsexperimente. In Anwesenheit von Fc-Block, fügen Antikörper Cocktails (100ul/0.5-1.0x10 6 Zellen), die Probenröhrchen. Inkubieren für 20-30 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Add 1 ml FACS-Puffer in jedes Röhrchen, um Wirbel zu mischen und Pellet die Zellen durch Zentrifugation. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal. </li><li> Dekantieren Sie den Überstand und resuspendierendie pelletierten Zellen in 300μl von 2% PFA. Führen Sie die Proben an einem Durchflusszytometer. <ul><li> Hinweis: In der Regel anti-CD45-Antikörper (gemeinsame Leukozyten-Antigen-Marker) ist für alle der Proben hinzugefügt, um Tor CD45 + Leukozyten später 7 Darüber hinaus CD45 FMO und Isotypkontrollen zunächst sollte verwendet werden, um die CD45 + Leukozyten Tor als Ort. CD45-Expression kann unter Leukozyten variieren. </li><li> Hinweis: Um low density Ausdruck Oberflächenantigene oder niedrige Veranstaltung Antigene erkennen, verwenden &quot;bright Fluorochrome&quot; wie R-Phycoerythrin (PE) oder Allophycocyanin (APC). Darüber hinaus können seltene Ereignisse durch die Bündelung von mehreren aufeinander abgestimmt Aorten gemeinsam erfasst werden, aber wenn mehr als eine Million Zellen verwendet werden, die Menge an Antikörpern pro Test verwendet werden proportional erhöht werden. </li><li> Hinweis: Um sicherzustellen, dass es minimal Blut Verunreinigungen in der isolierten Aorta und damit in der Aorta Zellsuspension, in einigen Experimenten zusätzliche Färbung wurde für TER-119, 7 ein Antigen von roten Blutkörperchen (RBC) Ausdruck durchgeführt. Die Zahl der RBC, um weiße Blutkörperchen (WBC) im Blut ist etwa 10x10 6 Zellen / ul bis 8x10 3 Zellen / ul. Basierend auf den Ausdruck der TER-119 in der Aorta Proben kann der Prozentsatz von Blut gewonnenen weißen Blutkörperchen in der Probe berechnet werden. In der Regel haben wir weniger als 0,02% von Blut gewonnenen WBC in der Aorta Proben. (Abb.1) </li><li> Hinweis: Da der Enzymbehandlung der Expression von Oberflächen-Antigene beeinflussen können, den Widerstand gegen Enzymverdau sollte für Antigene von Interesse bestimmt werden. Kurz gesagt, sind periphere Lymphknoten (PLN) oder kleine Stücke von Milz mit oder ohne Enzym-Cocktail für 1 Stunde bei 37 ° C. Nach 1 Stunde wird die Expression von Antigenen mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Das Enzym-Cocktail hat keine Auswirkung auf mehrere Oberflächen-Antigene (Abb. 2) 7. In einigen anderen Fällen führte die Enzymbehandlung in einem erheblichen Verlust an Antigen-Expression. Dieses Problem kann durch den Einsatz alternativer Zellmarkern umgangen werden. </li><li> Hinweis: Live / Dead Lebensfähigkeit der Zellen Färbung kann nach Schritt 4 ausgeführt werden, falls gewünscht. In der Regel verwenden Live / Dead Fixierbarer Dead Cell Stain Kit (Invitrogen, Molecular Probes). Um Flecken auf den Zellen mit Live / Dead Farbstoff, erstellen Sie eine 1x Live / Dead Lösung durch Zugabe von 1μl der wieder aufgelöst Live / Dead-Farbstoff in 1 ml PBS und Wirbel zu mischen. 100-200 ul 1x Live / Dead Farbstoff auf die Live / Dead-Einzel-, Cocktail-, FMO und Isotyp-Kontroll-Proben. Inkubieren Sie die Proben mit dem Farbstoff bei Raumtemperatur für 10 Minuten im Dunkeln. Die einzigen Steuerrohr für Live / Dead sollte bei 56 ° C inkubiert in der Dunkelheit für 10 Minuten, um die Zellen durch Hitzeschock zu töten. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml PBS und Pellet die Zellen durch Zentrifugation. Fortsetzen des Protokolls bei Schritt 5. </li><li> Hinweis: Intrazelluläre Färbung für intrazelluläre Antigene und Zytokine ist kompatibel mit diesem Protokoll. Kurz gesagt, kann die intrazelluläre Färbung erfolgt mit Zellfixierung / Permeabilisierung Reagenzien von BD Pharmingen, eBioscience oder Caltag Labors werden - abhängig von der Antigene von Interesse. Um dies zu beheben und permeabilisieren die Zellen für intrazelluläre Färbung, führen Sie die Fixierung / Permeabilisierung Schritt nach den Anweisungen des Herstellers, nach der extrazellulären Färbung Schritt (Abschnitt 3 Schritt 5). Nach der intrazellulären Waschschritt wieder unser Protokoll in Schritt 6 (Abschnitt 3 Schritt 6). </li></ul></li></ol> 4. Durchflusszytometrie-Analyse der isolierten Umgebung Adventitia und Gefäßwand Als Leukozyten an der Aorta Adventitia sowie atherosklerotischen Plaques in der Aortenwand, migrieren können Adventitia und Aorten-Leukozyten mittels Durchflusszytometrie untersucht ein Protokoll für die Isolierung und die Durchführung der Durchflusszytometrie auf diese beiden anatomischen entwickelt wurde. 9 kurz vor der ganzen Aorten sind mit ADES (Abschnitt 2, Schritt 2) der Aorta Adventitia ist teilweise verdaut und aus dem Rest des Schiffes verdaut. Sobald die Adventitia entfernt und beiseite stellen, den Rest der Aorta mit ADES zu Leukozyten aus der Gefäßwand zu befreien verdaut. <ul><li> Aorten-Adventitia Isolation Protocol </li></ul><ol><li> Nach der Vorbereitung des 1X ADES (Abschnitt 2 Schritt 1), vorzubereiten 2,5 ml / Aorta 1X Aorten-Adventitia Verdauung Enzymlösung (AADES) (781,25 U Collagenase II und 14,0625 U Elastase in 2.5mls PBS (Worthington Biochemical Corp, Lakewood, NJ )). 9 Legen Sie die Stammlösung auf Eis bis zum Gebrauch. </li><li> Entfernen Sie das PBS aus der Sammlung Röhrchen mit der Aorta. Fügen Sie 2,5 ml 1X AADES jedem Aorta. Schneiden Sie nicht die Aorta in kleine Stücke. Inkubieren Sie die Aorten mit dem 1X Adventitia Enzymlösung für 10-20 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Im Anschluss an die 10-20 Minuten die Verdauung, übertragen Sie die teilweise verdaute Aorta aus dem 1X AADES in eine Petrischale mit frischem PBS. Ganz vorsichtig, mit zwei Paaren von einer gebogenen Pinzette, schälen die Adventitia entfernt from der Aorta als eine Einheit. <ul><li> Hinweis: Längere Verdauung Zeiten machen es einfacher, die Adventitia zu entfernen, aber wenn die Adventitia über verdaut wird es zerreißen. </li></ul></li><li> Wenn die Adventitia vollständig entfernt worden ist, übertragen Sie die Adventitia und die Aorta zu trennen FACS-Röhrchen. Add 1 ml PBS, um die Adventitia Rohr, und setzen Sie den Schlauch auf dem Eis. Fügen Sie 2,5 ml 1X Aorta Dissoziation Enzymlösung zur Aorta Rohr und inkubieren die Aorta für 40 Minuten bei 37 ° C. <ul><li> Hinweis: Um die enzymatische Verdauung zu erleichtern, die Aorta kann in kleinere Teile an dieser Stelle geteilt werden. </li></ul></li><li> Nach der 40 Minuten Verdauung, statt der Aorta Röhrchen auf Eis und bereiten einzelne Zellsuspensionen aus der Aorta und Adventitia durch Scherung der Aorten-und Adventitia auseinander und indem sie durch einen 70 um Zellsieb in 5ml Polypropylen FACS-Röhrchen (BD Falcon). Pellet die Zellen durch Zentrifugation (400xg, 5 Minuten, 4 ° C). Zurück zu Abschnitt 2 Schritt 4 und wieder das Protokoll. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Hier präsentieren wir eine Reihe von Figuren, die Durchflusszytometrie Färbung, um das Immunsystem Zusammensetzung der gesamten Aorta, die Aortenklappe Gefäßwand und die umliegenden Aorten-Adventitia analysieren demonstriert. Zuerst zeigen wir eine repräsentative FACS Handlung, die eine TER-119-Färbung auf dem ganzen Blut und isolierten Aorten-Zellsuspension (Abb. 1) zeigt. TER-119-positiven roten Blutkörperchen entfielen 18% der Zellen in der Aorta Zellsuspension, die nur 0,014% der Zellen aus der Aorta Zellsuspensionen isolierten Blut-abgeleiteten zeigt. Dies ist eine wichtige Kontrolle Experiment, das zeigt deutlich, dass verdaut Schiffe, aber nicht zirkulierenden peripheren Blut ist die Quelle für die meisten Leukozyten in der Aorta Zellsuspension analysiert. Darüber hinaus zur Validierung der Methode untersuchten wir die Auswirkungen der Aorta Dissoziation Enzym-Cocktail auf Splenozyten Oberflächen-Antigene (Abb. 2). Das Enzym-Cocktail hat keine Auswirkungen auf die Expression verschiedener Antigene, einschließlich, CD45, CD19, CD3, TCRαβ, TCRγδ und mehrere andere Oberflächen-Antigene 7. CD45-Färbung in Verbindung mit Live / Dead Lebensfähigkeit Farbstoff und entsprechende Isotypkontrollen dienen zur Erkennung und sub-Gate große Populationen von Interesse und Zelltrümmer während der Analyse auszuschließen. In der Abb. 3, Live-Aorten-CD45 + Leukozyten wurden gated um den Prozentsatz der IFN bestimmen Υ + T-Zellen innerhalb der gepoolten Aorten von zwei jungen Apoe - / - Mäusen. Um zu betonen, die Vielseitigkeit dieser Methode mit dem Gating Schema in Abb. 3 dargestellt, präsentieren wir in Abb. 4 Vertreter intrazelluläre Färbung für CD68 + CD11b + Makrophagen und IFNy + TCRαβ + Zellen von zwei Apoe - / - Mäusen westliche Ernährung für 12 Wochen. Wie zu erwarten, in den westlichen Diät gefüttert Apoe - / - Aorten, sind die Mehrheit der Leukozyten innerhalb der Aorta Makrophagen (40% CD68 + CD11b +) oder anderen myeloischen Zellen (CD11b + CD68 niedrig und CD11b + CD68-). Darüber hinaus umfassen Th1-Zellen einen großen Teil der Aorta infiltrieren TCRαβ T-Zellen (Abb. 4). Da der Gesamtanteil der Aorta Leukozyten und Leukozyten-Untergruppen variiert je nach Alter der Maus und der Schwere der Atherosklerose, sollte die optimale Gating-Strategie für große Populationen von Interesse empirisch ermittelt werden Um die Machbarkeit der Isolierung der Aorta Adventitia für die Durchflusszytometrie-Färbung, präsentieren wir Vertreter CD45 + Leukozyten Färbung für Aorten-und Adventitia-Zellsuspensionen (Abb. 5). Kurz gesagt, drei Jahre alt Apoe - / - Maus wurden Aorten verdaut und zusammen, wie oben beschrieben vereinigt (§ § 2 und 4). Eindringen CD45 + Leukozyten wurden sowohl in der Adventitia (18% der Zellsuspension) und die restlichen Aorta (11% der Zellsuspension) nachgewiesen. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. TER-119-Färbung in verdaut Aorten-Zellsuspension. Aorta wurde durch Herzpunktion mit PBS mit 2% Heparin perfundiert. Dann wird die Aorta wurde mit dem Enzym-Cocktail für 1 Stunde bei 37 ° C verdaut Aorten-Zellen Federung und Blutprobe (als positive Kontrolle) wurden mit anti-TER-119-PE Abs gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. TER-119-positiven roten Blutkörperchen machen 18% aller Zellen in der Aorta Zellsuspension darauf hinweist, dass nur 0,014% aller Leukozyten aus Aorten isoliert wahrscheinlich Blut gewonnene Leukozyten werden. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Enzym-Cocktail Behandlung hat keine Auswirkungen auf die CD45 (oben) oder CD19 (unten) Expression auf Lymphozyten. </strong&gt; Zellsuspensionen aus unbehandelten (A, B) und mit Enzym-Cocktail (C, D) LN erhalten wurden, und gefärbt mit APC-Cy7-konjugierten anti-CD45 und APC-konjugierten anti-CD19-mAk. (A, C) Die Zahlen stellen den prozentualen Anteil der CD45 + Leukozyten in R1 Tor. (B, D) Die Zahlen stellen den prozentualen Anteil der CD45 + / CD19 +-Lymphozyten. Die Profile sind gated auf CD45 + Leukozyten. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3 Gating-Strategie für die Analyse von Aorten-Leukozyten Zwei Aorten wurden isoliert und von atherosklerotischen anfällig Apoe gebündelt -.. / - Mäuse und Aorten-Zell-Suspensionen wurden hergestellt wie oben beschrieben. Die Zellsuspensionen wurden für CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), IFNy (eFluor 450) und Live / Dead Aqua gefärbt, und unter Verwendung eines Cytek DXP 8 Farbe aufgewertet BD FACS Calibur. Kurz gesagt, wurden CD45 + Leukozyten gated (B) und weiter analysiert (CF). Tote Zellen wurden aus der Analyse von Live / Dead Aqua-Färbung (D) und FSC Grundstücke (E) basiert entfernt. Live-Aorten-Leukozyten wurden dann für TCRαβ und IFNy Ausdruck (F) untersucht. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> .. / - - Abbildung 4 Intrazelluläre Färbung für intrazelluläre Antigene und Zytokine Zellsuspensionen wurden aus einer ganzen Apoe vorbereitet Aorta und Milz, wie beschrieben. Aorten (A) und Milz (B, C) Zellsuspensionen wurden für CD45, CD11b und CD68 oder einem Isotyp-Kontrolle mit BD Cytofix / Cytoperm ™ Kit (BD Biosciences) gefärbt. Die Zellen wurden gated auf CD45 + Leukozyten und Schutt wurde auf Basis der Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht-Profile ausgeschlossen. Für intrazelluläre IFN &amp;ggr;-Färbung, Aorten-und Milz Zellsuspensionen wurden für fünf Stunden in RPMI 1640 mit Golgi stoppen, PMA und Ionomycin C ergänzt kultiviert, wie zuvor beschrieben. 9 Stimulated einzigen Aorta (D) und Milz (E, F) Zellsuspensionen wurden anschließend mit CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), CD3 (APC-Cy7) gebeizt, Live Dead Aqua und IFNy (eFluor 450; E) oder einem Isotyp (IgG1-eF450, F). T-Zellen (DF) wurden gated von Live-CD45 + CD3 + Leukozyten (CD45 + Live / Dead Aqua-) geprüft und für TCRαβ und IFNy. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig5.jpg" alt="Abbildung 5"/> .. Abbildung 5 Representative Bild von isolierten Maus-Aorten-Adventitia und Aorta Gefäßwand Vertreter Durchflusszytometrie Zähler Plot zeigt die Anwesenheit von CD45 + T-Zellen in der Adventitia und Aortenwand von Alter Apoe - / - Mäusen. SSC-side scatter. Zur Vermeidung von Autofluoreszenz von Schutt und nekrotisches Gewebe wurden Grundstücke gated für FSC&gt; 750. Zur Vermeidung von zusätzlichen Autofluoreszenz von Dubletten die Tore auch als FSC &lt;3500, SSC &lt;3500 gesetzt wurden. Die Prozentangaben zeigen CD45 +-Zellen in den Toren.

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Hier präsentieren wir eine Durchflusszytometrie-basierte Methode für die Untersuchung der Immunzellen Zusammensetzung der murine Aorten. Der große Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, Aorten-Immunzellen bei einer einzigen Zelle Ebenen zu analysieren und die Aktivierung Status der Aorta Leukozyten charakterisiert. Diese Methode ist nicht auf murine Aorten beschränkt und wir (unveröffentlichte Daten) und andere 10 verwendet diesen Ansatz für die menschliche Präparate wie z. B. Arteria mammaria, A...

<table border="1"><tbody><tr><td> Material </td><td> Catalog Number </td><td> Firma </td></tr><tr><td> Collagenase XI </td><td> C7657 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> H3506 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> DNase I, Typ-2- </td><td> D4527 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Collagenase I </td><td> C0130 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Collagenase II </td><td> LS004174 </td><td> Worthington Biochemical Corporation </td></tr><tr><td> Elastase </td><td> LS002292 </td><td> Worthington Biochemical Corporation </td></tr></tbody></table>

flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas

Atherosklerose ist eine chronisch entzündliche Prozess der mittelgroßen und großen Schiffen, die durch die Bildung von Plaques, bestehend aus Schaumstoff, Immunzellen, vaskuläre Endothel-und glatten Muskelzellen, Thrombozyten, extrazelluläre Matrix und einer Lipid-reichen Kern mit ausgedehnter Nekrose gekennzeichnet ist und Fibrose des umgebenden Gewebes. 1 Die angeborene und adaptive Arme der Immunantwort bei der Initiierung, Entwicklung und Persistenz von Atherosklerose beteiligt. 2, 3 gibt es eine beträchtliche Menge Beweise dafür, dass verschiedene Untergruppen der Immunzellen, wie Makrophagen, dendritische Zellen, T-und B-Lymphozyten sind innerhalb des Aorten von gesunden und Arteriosklerose anfällig Mäusen 4. Darüber hinaus sind Immunzellen in das umgebende Aorten-Adventitia, die eine wichtige Rolle dieses Gewebes schlägt in der Atherogenese gefunden. 2 Für einige Zeit war die quantitative Bestimmung der verschiedenen Arten von Immunzellen, deren Aktivierung den Status und die zelluläre Zusammensetzung innerhalb der Aortenwand durch RT-PCR und immunhistochemische Methoden zur Untersuchung der Atherosklerose beschränkt. Nur wenige wurden Versuche unternommen, die Durchflusszytometrie mit menschlichen Aorten durchzuführen, und eine Reihe von Problemen, wie zum Beispiel eine hohe Autofluoreszenz, berichtet worden 5,6. Humanen atherosklerotischen Plaques wurden mit Collagenase 1 verdaut und freie Zellen wurden gesammelt und für CD14 gefärbten + / CD11c + zu Makrophagen-abgeleitete Schaumzellen Highlight. In dieser Studie wurde ein &quot;Mock&quot;-Kanal verwendet werden, um falsch-positive Färbung zu vermeiden. 6 Necrotic Materialien sammeln während des Aufschlusses entstehen in einer großen Menge von Trümmern, die eine hohe Autofluoreszenz in der Aorta Proben erzeugt. Um dieses Problem zu lösen, hat ein Gremium von negativen und positiven Kontrollen vorgeschlagen worden, aber nur Doppelfärbung konnte in diesen Proben angewendet werden. Wir haben eine neue Basis der Durchflusszytometrie-Methode 7 an die Immunzellen Zusammensetzung zu analysieren und zu charakterisieren, die Aktivierung, Proliferation, Differenzierung von Immunzellen bei gesunden und Arteriosklerose anfällig Aorta entwickelt. Diese Methode erlaubt die Untersuchung der Immunzellen Zusammensetzung der Aortenwand und öffnet Möglichkeiten für ein breites Spektrum von immunologischen Methoden zur Untersuchung des Immunsystems Aspekte dieser Krankheit verwendet werden.

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Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Dieser Beitrag stellt eine Durchflusszytometrie-basierte Methode, um das Immunsystem Zusammensetzung der Aorta zu untersuchen. Das Papier zeigt auch eine weitere Technik, die Prüfung umgebenden Adventitia und Gefäßwand getrennt werden können. Diese Methode eröffnet Möglichkeiten, um phänotypische Analysen der Aorta Leukozyten führen und in mehreren immunologischen Assays für die Atherosklerose-Studien.

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.4K Aufrufe.  Eastern Virginia Medical School. Dieser Beitrag stellt eine Durchflusszytometrie-basierte Methode, um das Immunsystem Zusammensetzung der Aorta zu untersuchen. Das Papier zeigt auch eine weitere Technik, die Prüfung umgebenden Adventitia und Gefäßwand getrennt werden können. Diese Methode eröffnet Möglichkeiten, um phänotypische Analysen der Aorta Leukozyten führen und in mehreren immunologischen Assays für die Atherosklerose-Studien.

Serie: Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Mess-Calpain Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Qualitative und Quantitative Analyse der immun Synapse im menschlichen System mit Hilfe von Imaging Durchflusszytometrie

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. Setup of a classic multicolor panel requires high-end instruments, custom labeled antibodies, and careful study design to minimize spectral overlap. We developed a multiparametric analysis to identify major human immune populations (CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes) in peripheral blood by combining seven lineage markers using only two fluorochromes. Our strategy is based on the observation that lineage markers are constantly expressed in a unique combination by each cell population. Combining this information with a careful titration of the antibodies allows investigators to record five additional markers, expanding the optical limit of most flow cytometers. Head-to-head comparison demonstrated that the vast majority of immune cell populations in peripheral blood can be characterized with comparable accuracy between our method and the classic &#34;one fluorochrome-one marker approach&#34;, although the latter is still more precise for identifying populations such as NKT cells and &#947;&#948; T cells. Combining seven markers using two fluorochromes allows for the analysis of complex immune cell populations and clinical samples on affordable 6-10 fluorochrome flow cytometers, and even on 2-3 fluorochrome field instruments in areas with limited resources. High-end instruments can also benefit from this approach by using extra fluorochromes to accomplish deeper flow cytometry analysis. This approach is also very well suited for screening several cell populations in the case of clinical samples with limited number of cells.

Here, we present a flow cytometric protocol to identify CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes in human peripheral blood by using only two fluorochromes instead of seven. With this approach, five additional markers can be recorded on most flow cytometers.

Diskriminierung von sieben Immunzelle Teilmengen von zwei-Fluorochrom Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

Isolierung von Maus-Kidney-Resident-CD8+ T-Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are widely used as a convenient cell system for analyzing SAMHD1 activity due to a low level of SAMHD1 RNA expression, leading to undetectable endogenous protein expression. Based on similar assays developed in the Stoye laboratory to characterize other retroviral restriction factors, the Bishop lab developed a two-color restriction assay to analyze SAMHD1 in U937 cells. Murine Leukaemia Virus-like particles expressing SAMHD1, alongside YFP expressed from an IRES, are used to transduce U937 cells. Cells are then treated with phorbol myristate acetate to induce differentiation to a quiescent phenotype. Following differentiation, cells are infected with HIV-1 virus-like particles expressing a fluorescent reporter. After 48 h, cells are harvested and analyzed by flow cytometry. The proportion of HIV-infected cells in the SAMHD1-expressing population is compared to that in internal control cells lacking SAMHD1. This comparison reveals a restriction ratio. SAMHD1 expression leads to a five-fold reduction in HIV infection, corresponding to a restriction ratio of 0.2. Our recent substitution of RFP for the original GFP as the reporter gene for HIV infection has facilitated flow cytometry analysis.
This assay has been successfully used to characterize the effect of amino acid substitutions on SAMHD1 restriction by transducing with viruses encoding altered SAMHD1 proteins, derived from site-directed mutagenesis of the expression vector. For example, the catalytic site substitutions HD206-7AA show a restriction phenotype of 1, indicating a loss of restriction activity. Equally, the susceptibility of different tester viruses can be determined. The assay can be further adapted to incorporate the effect of differentiation status, metabolic status, and SAMHD1 modifiers to better understand the relationship between SAMHD1, cell metabolic state, and viral restriction.

Described here is an established method to determine the extent of HIV-1 restriction by the cellular inhibitory protein SAMHD1. Human myeloid lineage U937 cells are transduced with a SAMHD1 expression vector co-expressing YFP, differentiated and then challenged with HIV-RFP. The level of restriction is determined by flow cytometry analysis.

Analyse der SAMHD1-Restriktion durch Durchflusszytometrie in humanen myeloischen U937-Zellen

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...