Diese Arbeit wurde von der NSF CAREER CBET-0747615 gefördert. Die Autoren bedanken sich bei Dr. danken. Douglas H. Smith und David F. Meaney für ihre Betreuung und Unterstützung.

1. Übersicht über die Axon Stretch Growth Bioreaktor-System <ol><li> Zwei vorherrschende Ansätze wurden verwendet, um experimentelle Kräfte zu Neuronen gelten. Im ersten Ansatz werden die Kräfte auf die gesamte Neuron (.; Chetta, Kye et al 2010;.. Lindqvist, Liu et al 2010 Lu, Franze et al 2006) angewendet. Im zweiten Ansatz werden die Kräfte direkt auf das Axon, indem Sie auf das Wachstum Kegel aufgetragen. Mit Glasnadeln hat dieser zweite Ansatz zur Modellierung Bildung neuer Axon (.; O&#39;Toole, Lamoureux et al 2008;.. Bernal, Pullarkat et al 2007 Lamoureux, Heidemann et al 2010) verwendet wurde, zu zwingen, Schwellenwerte für die Dehnung zu identifizieren und Abfahren (Dennerll, Lamoureux et al 1989;. Zheng, Lamoureux et al 1991;.. Lamoureux, Zheng et al 1992), auf und Neurotransmitter-Clustering in Axonterminalen analysieren (Siechen, Yang et al 2009).. Eine einzigartige Tissue Engineering Erweiterung dieser Methode wurde entwickelt, um große Nervenzellen produzieren Konstrukte mit Hilfe eines automatisierten Axon Stretch Growth (ASG) Bioreaktor-System (Iwata, Browne et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). Vor kurzem haben wir eine miniaturisierte Version der Bioreaktor-System zu studieren ASG mikroskopisch in Echtzeit (Loverde, Ozoka et al. 2011). Hier beschreiben wir die 9-Tage-Protokoll (Tabelle 1) die wir derzeit zur Bioreaktoren vorzubereiten und durchzuführen ASG routinemäßig. </li><li> Insgesamt Operation: Die ASG-Bioreaktor-System besteht aus drei Hauptkomponenten, 1) einen Bioreaktor Kammer mit unabhängigen Bahnen (längliche Vertiefungen), wo Neuronen kultiviert und gedehnt werden, 2) eine automatisierte lineare Bewegung Tabelle Dehnungskräfte und 3) einen Schrittmotor gelten zusammen Antriebsregler mit Software zu strecken Wachstum (Abbildung 1) zu kontrollieren. </li><li> Kurz gesagt, wurde die Herstellung von Prototypen Bioreaktor in einer Maschinenhalle mit einem Vertikal-Fräsmaschine (Bridgeport, Elmira, NY) durchgeführt. Für Biokompatibilität, einfache Sterilisation und Haltbarkeit wurden die internen Bioreaktor Komponenten von 3 / 8 &quot;Polyetheretherketon (PEEK) gefertigt. Transparentes Polycarbonat wurde für Deckel verwendet werden, um für die Lichtmikroskopie und Anzeigen von Kulturen zu ermöglichen. Korrosionsbeständige Edelstahl 316 Schrauben und Hardware komplett die Montage (McMaster-Carr, Elmhurst, IL). </li><li> Der Bioreaktor Kammer besteht aus einem Spannrahmen, dass 3 Fahrspuren, eine einstellbare Schlepp-Block, der Zellen in den Gassen manipuliert und hervorstehende Abschleppen Stangen Formulare für externe Manipulation (Abbildung 2) besteht. Neuronale Kulturen werden auf Einweg-Aclar Abschleppen Kultur Substrate durch das Abschleppen Block (Abb. 2 &amp; 3) unterstützt überzogen. Ein Einweg-Deckglas stationären Substrat wird an der Unterseite des Spannrahmens und erstreckt sich über alle 3 Fahrspuren. Vor Stretching, müssen verzinkt Neuronen axonalen Prozessen aus dem Abschleppen Substrat hinaus auf die stationären Substrat über Wachstum Kegel-Erweiterung. Die Bevölkerung der Axone, die Brücke der Substrate werden anschließend unterziehen Strecke durch die Kontrolle Verschiebung der Schlepp-Block. </li><li> Die automatisierte lineare Bewegung Tisch besteht aus einem Schrittmotor (HT23-397, Applied Motion Products, Watsonville, CA) und eine lineare Bewegung Tabelle (MIPS-2-10-1.0mm, Servo Systems, Monteville, NJ), montiert auf eine delrin Ausrichtung Tisch . Der Bioreaktor Kammer ist in der Tabelle parallel zur linearen Bewegung Tisch. Das Abschleppen Stangen, die sich von den Bioreaktor Kammer sind die lineare Bewegung Tabelle mit Hilfe eines Adapters befestigt. </li><li> Der Schrittmotor-Controller (Si 2035, Applied Motion Products) ist so programmiert, mit dem mitgelieferten Si Programmierer Software zur Manipulation des ziehenden Substrate zu steuern. Axonal Strecke ist in einem schrittweise, indem sie eine Reihe von kleinen Verschiebung Schritte Verweilzeiten (..; Pfister, Iwata et al 2006 Pfister, Iwata et al 2004) Abstand aufgebracht. Das computergesteuerte System bietet die Möglichkeit, individuelle Profile für ASG-Programm, und ist von wesentlicher Bedeutung für die kontinuierliche Experimentieren über mehrere Tage bis Wochen. </li></ol> 2. Vorbereitung des Bioreaktors Kammer <ol><li> Bereiten Sie die Einweg-Abschlepp-und stationären Kultur Substrate für neuronale Kultur: <ol><li> Abschleppen Kultur Substrate von 8,5 cut &quot;x 11&quot; Blatt Aclar Film (33C 2,0 Mio., Struktur Probe, West Chester, PA). Mit einem scharfen Messer schneiden Sie die Substrate auf ca. 0,5 x 2,5 cm, oder etwas kürzer als die Breite der Fahrspuren auf mindestens 1-2mm Abstand auf beiden Seiten zu ermöglichen. </li><li> Schleifen Sie die unteren 1 / 3 rd des Zugfahrzeugs Kultursubstraten auf beiden Seiten mit feinen 1200-Schleifpapier (McMaster Carr). Schleifen des ziehenden Substrate ermöglicht Wachstum von Axonen aus dem Abschleppen Substrate auf das Deckglas stationären Substrat. </li><li> Schneiden Sie ein 5 x 7cm Stück Aclar oder verwenden Sie einen Nr. 1 Deckglas als die stationäre Substrat dienen (# 4865-1, Brain Research Labs, Newton, MA). </li><li> Saubere the Kultur Substrate mit einer verdünnten Lösung Alconox und gründlich mit gereinigtem dH 2 O. </li><li> Sterilisieren der Kultur Substraten durch Eintauchen in 70% Ethanol für 30 Minuten. Lassen Sie die Substrate an der Luft innerhalb einer sterilen Gewebekultur Haube trocknen. </li></ol></li><li> Reinigen Sie den Bioreaktor Kammer mit verdünnter Alconox und Autoklaven in einem Autoklaven Behälter zu sterilisieren. Unmittelbar nach dem Autoklavieren, um eine sterile Haube übertragen und an der Luft trocknen. </li><li> Weiterbildung innerhalb der sterile Haube, kleben Sie die Kultur Substrate in den Bioreaktor mit Silicon RTV (Dow Corning # 732, McMaster Carr) und sterile Wattestäbchen Abstriche (McMaster Carr): <ol><li> Mit dem Abschleppen Block Beine in voller aufrechter Position, Leim das Schleppen Kultur Substrate, die Schlepp-Block Beine an den Nicht-geschliffen Teil. Vermeiden Sie den Kontakt mit der geschliffenen Oberfläche Kultur. </li><li> Kleben Sie die stationäre Kultur Substrat auf den Boden des Bioreaktors Kammer. </li><li> Entfernen Sie überschüssigen Kleber und Lufteinschlüsse durch leichtes Drücken einer trockenen Tupfer gegen die verklebten Substrate. </li><li> Da Silikon RTV Laugen Essigsäure, die giftig für Neuronen ist, wird der Bioreaktor links unter UV-Licht innerhalb der Haube trocknen 2 volle Tage vor der Einführung von neuronalen Kulturen. </li></ol></li><li> Senken Sie die Schlepp-Block Beine zu einem 2-3mm Überlappung zwischen den Spitzen der geschliffen Abschleppen Substraten und dem stationären Substrat zu erreichen. Entscheidend Augenmerk muss auf die Größe der Überlappung bezahlt werden, wenn sie zu groß ist, die Spitzen der Schlepp-Substraten kann abzulenken off der stationären Substrat; Reduzierung der Anzahl der Axone, die die Überlappung (Abbildung 3) umfassen. </li><li> Positionieren Sie den Schlepp-Block an der Ausgangsposition, mit dem Abschleppen Stäbe eingefahren Inneren des Bioreaktors. Ziehen Sie die Immobilisierung Schrauben zur Bewegung des Zugfahrzeugs Stangen vor zu verhindern, um Wachstum zu strecken. </li></ol> 3. Neuronalen Kulturen <ol><li> Pool 1 ml von 10 pg / mL hochmolekularen Poly-D-Lysin (cat # 354210, BD, Bedford, MA) in serum-freien Medien an der Substrat-Grenzfläche von jeder Spur. Lassen Sie die Lösung haften für 1 Stunde bei Raumtemperatur ungestört. Spülen Sie vorsichtig 3x mit dH 2 O, durch eine abschließende Spülung mit Kulturmedien gefolgt. Pipettieren sollten auf der Rückseite der Bahnen durchgeführt werden, am weitesten dem Substrat-Schnittstelle. </li><li> Isolieren Spinalganglien Explantate (DRGs) aus einem E16 Jungtier. Mit einem Stereomikroskop, verdünnte die Explantate in Tropfen mit Petrischalen. Sammeln Sie 3-4 Explantate mit einem 100 ul Pipette und Teller auf den Rand des geschliffenen Abschleppen Kultur Substrat. Es muss auf den Teller der Explantate am Rande des Zugfahrzeugs Substrat mit einer kleinen Pfütze Medien aufgegriffen werden. Bis zu 1 ml der Kultur Medien pro Spur genügt, um die Verdampfung für mehrere Stunden zu verhindern, während Begrenzung der Bewegung der Explantate. Medien Formulierung: Neurobasal mit B-27 + 0,5 mM L-Glutamin (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% FBS-HALLO (Hyclone, Waltham, MA), 2,5 g / L D-Glucose (G-7528, Sigma, St . Louis, MO), 20ng/mL NGF (13290-010, Invitrogen) und 20 uM FdU + 20 uM Uridin Mitosehemmer (F-0503, U-3003, Sigma). </li><li> Bringen Sie den Deckel und den Transfer der Bioreaktor in einen Inkubator für 1 Stunde oder bis die Zellen anhaften. </li><li> Füllen Sie den Bioreaktor mit Kulturmedien an dem Punkt am weitesten die Explantate auf dislodgment zu vermeiden. Inkubieren der Bioreaktor für mindestens 5 Tage, während Neuronen axonalen Fortsätze auf den stationären Substrat. </li></ol> 4. Axon Stretch Growth <ol><li> Der Bioreaktor erfährt letzten Vorbereitungen Verfahren in einem sterilen Haube: <ol><li> Füllen Stauseen im Bioreaktor mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung in die Kammer und begrenzen Verdampfung von Kulturmedien zu befeuchten. In unserem System dienen die ausgehöhlten Gehäusewände als Reservoir. Alternativ können kleine Petrischale Deckeln auf beiden Seiten des ziehenden Block oben auf der Kultur Bahnen platziert werden. </li><li> Ersetzen Sie den Kulturmedien und füllen die Gassen, um die Kapazität. Pipettieren sollten auf der Rückseite der Bahnen durchgeführt werden, am weitesten dem Substrat-Schnittstelle. </li></ol></li><li> Sitz der Bioreaktor in der automatisierten lineare Bewegung Tisch. Wenn das Experiment ist es, innerhalb eines Inkubators ausgeführt werden, es darf nicht befeuchtet werden wegen möglicher Korrosion der automatisierten lineare Bewegung Tisch. </li><li> Befestigen Sie die Schleppstange Adapter mit dem Abschleppen Stangen. </li><li> Mit Si Programmer Software Jog der Bühne der linearen Bewegung Tabelle mit den Schleppstange Adapter ausrichten und befestigen Sie ihn auf die Bühne. Für die Bequemlichkeit, bereiten Si Programmer-Sequenzen im Voraus, um die Bühne in bestimmten Schritten zu manipulieren. </li><li> Lösen Sie die Schrauben auf der Immobilisierung Bioreaktor Kammer auf Freizügigkeit des ziehenden Block zu ermöglichen. </li><li> Stretch ist in schrittweise durch die Initiierung einer Reihe von kleinen Verschiebung Schritte Verweilzeiten (Pfister, Iwata et al. 2006) Abstand aufgebracht. Unser Paradigma beginnt, indem sie 2 pm Schritte jede 172 Sekunden,was zu einem Netto-1mm erstrecken sich über 24 Stunden. Nach einem Tag können die Strecke Rate werden durch die Erhöhung der Verschiebung oder Verringerung der Verweildauer (Tabelle 2) hochgefahren. </li><li> Sobald ASG eingeleitet wird, sind Medien Veränderungen in der Regel nicht erforderlich. Im Laufe der Zeit jedoch Kulturmedien in der Regel wird sauer und ist offensichtlich durch eine gelbliche Verfärbung. Wenn weitere Experimente erforderlich ist, alte Medien nie vollständig entleert, sondern nur teilweise geändert werden, um Traumata zu schweben Axone zu minimieren. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Axonal Prozesse durchlaufen bemerkenswert schnelle und robuste Strecke Wachstum. Zunächst beginnt der Prozess mit einer Periode langsamen Strecken (≤ 1mm/day), die von kleinen, selten Verschiebungen besteht. Innerhalb der ersten 24 Stunden nach der Dehnung, Mechanotransduktion des neuronalen Wachstums Wege erfolgt, wobei Neuronen beginnen neben dem Axon Zylinder. Innerhalb von 24 Stunden ununterbrochene ASG, zeigen Axone eine wachsende Toleranz gegenüber stärkere und häufigere Verschiebungen. Im Allgemeinen können Axone standhalten eine Zunahme der Strecke von 1mm/day alle 12-24 Stunden (Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). Die Erhöhung der Stretch-Rate zu früh, kann jedoch zu einem schnelleren Wachstum der Axone wählen führen, sondern auch zu pathologischen Okklusion, dass die Trennung Ursachen führen. Stretch-wachsenden Axone haben die Tendenz, Bündel bilden, ähnlich der Architektur der Faszikel. Mit Hilfe gängigen Protokolle, die zentrale, Stretch gewachsen Teil des Axon bündelt keine Verwachsungen, die Kultur Substrat. Nur die zunächst verklebt, proximalen und distalen Segmente der Strecke wachsenden Axone verbunden bleiben, um die Kultur Substraten. Dementsprechend treiben den zentralen Teil der Strecke gewachsen Axone frei und sind empfindlich gegen Störungen durch die Handhabung. Für eine Vielzahl von Gründen, können einige Axone nicht an der Strecke angewendet Rate wachsen. Zum Beispiel, ein DRG Neuron mit zwei axonalen Prozessen, die beide durchlaufen strecken, sind möglicherweise nicht in der Lage, ausreichend Protein übersetzen und zu wachsen bei den angewendeten Reckrate. Axone, die nicht unterbringen kann die angelegte Strecke wird nach Poisson-Effekt dünn. Nachfolgende Strecke wird zum Verschluss der Axone hemmen Montage führen, was zu pathologischen Trennung. Die Mehrzahl der Axone, sind jedoch in der Lage zu unterziehen ASG erfolgreich und nur ein kleiner Prozentsatz der Axone unterziehen diesem Schnitt-like-Prozess. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig1.jpg" /> Abbildung 1. Axon Stretch Growth Bioreaktor-System. (A) Bioreaktor Zellkulturkammer &amp; Automated lineare Bewegung Tisch, (B) Schrittmotor-Controller und Si Programmiersoftware. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig2.jpg" /> Abbildung 2. Bioreaktor Kultur Kammer. Diese Karikatur zeigt den Bioreaktor Kammer von oben mit dem Deckel entfernt. Die Position des ziehenden Block spiegelt das Endstadium Axon Stretch-Wachstum. Stretch gewachsen Axone können in Bündeln innerhalb der Kultur Gassen zu sehen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig3.jpg" /> Abbildung 3. Nährsubstrat Plating-Schnittstelle. Diese Karikatur zeigt die Komponenten des ziehenden Mechanismus innerhalb jeder Spur des Bioreaktors aus der Seitenansicht. (Top) Korrigieren Überlappung der Abschlepp-und stationären Kultur Substraten. (Bottom) Übermäßige Überlappung der Abschlepp-und stationären Substraten bewirkt, dass die Spitze des Zugfahrzeugs Substrat zu kräuseln. Movie 1. Befestigung der Kultur Substrate zu Bioreaktor Kammer. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie1.mov">Klicken Sie hier, um Video anzuschauen</a> Movie 2. Plating der DRG Explantate auf Abschleppen Substrate. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie2.mov">Klicken Sie hier, um Video anzuschauen</a> Movie 3. SiProgrammer Usage. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie3.mov">Klicken Sie hier, um Video anzuschauen</a> Movie 4. Growth Cone-Erweiterung auf stationären Substrat. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie4.mov">Klicken Sie hier, um Video anzuschauen</a> Movie 5. Axon Stretch Growth. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie5.mov">Klicken Sie hier, um Video anzuschauen</a> <table border="1"><tbody><tr><td> Tag </td><td> Schritt </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Sterilisation und Trocknung </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Kleben &amp; Montage </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Coatings &amp; Neuronale Kultur Plating</td></tr><tr><td> 9 </td><td> Stretch Growth Anfang </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Experiment Schedule. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Time [hr] </td><td> Stretch Rate [mm / Tag] </td><td> Verweilzeit [s] </td><td> Gesamtlänge [mm] </td><td> Insgesamt Stretch Zeit [Tage] </td></tr><tr><td> Anspruch </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Strecken </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Strecken </td><td> 24 </td><td> 2 </td><td> 86,4 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Strecken </td><td> 24 </td><td> 3 </td><td> 57,6 </td><td> 6 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Strecken </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 43,2 </td><td> 10 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Strecken </td><td> 24 </td><td> 5 </td><td> 34,6 </td><td> 15 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Stretch Rate Schedule. Alle strecken Schritte sind 2 um Verschiebung (10 Schrittmotor Schritte = 2 pm Dehnung).

<ol>
	<li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+axons.">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li><li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension.">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li><li>Chetta, J., Kye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+in+response+to+tensile+loading+of+mammalian+axons.">Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).</li><li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction.">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li><li>Fu, S. Y., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+and+molecular+basis+of+peripheral+nerve+regeneration.">The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).</li><li>Gray, C., Hukkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neural+growth:+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+P-+containing+nerves+attain+exceptional+growth+rates+in+regenerating+deer+antler.">Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler.</a> Neuroscience. 50, 953-963 (1992).</li><li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+as+a+regulator+and+integrator+of+axonal+growth.">Tension as a regulator and integrator of axonal growth.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).</li><li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+as+a+regulator+of+axonal+development.">Mechanical tension as a regulator of axonal development.</a> Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).</li><li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytomechanics+of+axonal+development.">Cytomechanics of axonal development.</a> Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).</li><li>Iwata, A., Browne, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+survival+and+outgrowth+of+mechanically+engineered+nervous+tissue+constructs+implanted+into+spinal+cord+lesions.">Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions.</a> Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).</li><li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon.">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li><li>Lamoureux, P., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytomechanical+investigation+of+neurite+growth+on+different+culture+surfaces.">A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces.</a> J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).</li><li>Lindqvist, N., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+glial+(Muller)+cells:+sensing+and+responding+to+tissue+stretch.">Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).</li><li>Loverde, J. R., Ozoka, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Axon+Stretch+Growth+in+Embryonic+and+Adult+Neurons.">Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons.</a> J. Neurotrauma. , (2011).</li><li>Lu, Y. B., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS.">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).</li><li>O'Toole, M., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physical+model+of+axonal+elongation:+force,+viscosity,+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth.">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li><li>Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-grown+axons+retain+the+ability+to+transmit+active+electrical+signals.">Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals.</a> FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).</li><li>Pfister, B. J., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+Engineering+Strategies+for+Peripheral+Nerve+Repair:+Surgical+Applications,+State+of+the+Art,+and+Future+Challenges.">Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges.</a> Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).</li><li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons.">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li><li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons.">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li><li>Siechen, S., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+contributes+to+clustering+of+neurotransmitter+vesicles+at+presynaptic+terminals.">Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).</li><li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts:+extremes+and+exploitations.">Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li><li>Smith, D. H., Wolf, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+to+produce+sustained+growth+of+central+nervous+system+axons:+continuous+mechanical+tension.">A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension.</a> Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).</li><li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+patterns:+The+mechanics+of+nerve+growth.">Nerve patterns: The mechanics of nerve growth.</a> Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).</li><li>Zheng, J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensile+regulation+of+axonal+elongation+and+initiation.">Tensile regulation of axonal elongation and initiation.</a> J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).</li></ol>

Die ex-vivo mechanische Dehnung der neuronalen Zellen ist unter US-Patente # 6264944 und # 7429267 patentiert.

Zwei kritische Schritte sollten bei der Zubereitung von Bioreaktoren beobachtet werden. Zunächst wird eine optimale Überlappung bei der Substrat-Grenzfläche notwendig, um sicherzustellen, dass Axone kann auf die stationären Substrat zu überqueren. Aclar, dass übermäßig gewellt oder anderweitig unvollkommenen sollte nicht verwendet werden (Abbildung 3). Zur Optimierung der Überlappung, bestätigen, dass das Schleppen Substrat gleichmäßig und geschliffen Kontakte der stationären Substrat gleichmäßig über eine 2-3mm lang Aufstandsfläche. Die Überlappung sollte vor jedem Versuch durch eine sorgfältige Einstellung der Höhe des ziehenden Beinen optimiert werden. Zweitens, und gleichzeitig zur Befestigung von Neuronen, Sustain Substratbeschichtungen erhebliche Sheering Kräfte, die durch Verschiebung des Bioreaktors und kontraktile Spannung der Axone (Heidemann und Buxbaum 1990; Pfister, Iwata et al 2004;.. Loverde, Ozoka et al 2011) verursacht. Substrate gründlich mit sterilem Wasser gespült werden sowohl vor als auch nach Lysin-Beschichtung. Coatings sollte frisch aufgetauten Aliquots aufgetragen werden und die Ausbreitung so gleichmäßig wie möglich. Wichtig ist, dass die Substrate nicht verschoben oder anderweitig gestört während die Haftung Zeitraum. In weiteren Schritten, sollte der Kontakt mit den Substraten während Plattieren und Pipette alle Lösungen vom anderen Ende der Gassen von dem Substrat weg Schnittstelle. Toleranzen in den Verbindungen der einzelnen Bioreaktor-Komponente kann sich in Form von locker. Während der ersten Zeit der ASG ist locker in das System offensichtlich als Bewegung der automatisierten lineare Bewegung Tisch kommt ohne Bewegung des Zugfahrzeugs zu blockieren. Slack kann pro Experiment variieren, liegt aber typischerweise &lt;1 mm in unserer Erfahrung. Aus diesem Grund, eine &quot;Vorspannung&quot; slack Eliminationsphase von 1mm/day, für einen Tag geht die ASG Zeitplan, in dem der Bioreaktor Teile engagieren und beginnen Bewegung des ziehenden Substrate. Fehlerbehebung erforderlich, wenn die Verschiebung Schritt der automatisierten lineare Bewegung Tabelle nicht mit der Verschiebung der Schlepp-Block nach der Vorspannung Phase abgeschlossen ist. Asynchronous, fehlerhafte Verschiebungen der Schlepp-Block mit &quot;Haftreibung&quot; oder Haftreibung im Schlepp Hardware und Durchbiegung der Adapter verbunden. Zur Vermeidung dieser Probleme auftritt, sollte Bewegung des ziehenden Block von Hand überprüft werden, nach der Montage, für glatte nahezu mühelose Bewegung. Wenn verbindliche auftritt, sollte das Schleppen der Montage vor Experimentieren befreit werden. Ausreichende Steifigkeit des Adapters ist auch notwendig, um genaue, Synchron-Verschiebungen versichern nicht überwunden werden durch Haftreibung des Zugfahrzeugs Hardware.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name der Komponente </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Polyetheretherketon (PEEK) </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8504K69 </td><td> Custom made Bioreaktor Kammer </td></tr><tr><td> Polycarbonat </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8574K28 </td><td> Custom made Bioreaktor Kammerdeckel </td></tr><tr><td> Schrittmotor </td><td> Applied Motion Products, Watsonville, CA </td><td> HT23-397 </td><td></td></tr><tr><td> Linear Motion Tisch </td><td> Servo Systems, Montville, NJ </td><td> MIPS-2-10-1.0mm </td><td></td></tr><tr><td> Schrittmotor-Controller </td><td> Applied Motion Products, Watsonville, CA </td><td> Si2035 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar </td><td> Structure Probe Inc., West Chester, PA </td><td> 1859 </td><td> Abschleppen Kultursubstraten </td></tr><tr><td> Nr. 1 Deckglas </td><td> Brain Research Labs, Newton, MA </td><td> 4865-1 </td><td> Stationäre Kultursubstrat </td></tr><tr><td> Silicon RTV </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7587A37 </td><td></td></tr><tr><td> Wattestäbchen Abstriche </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7074T62 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lysin </td><td> BD, Bedford, MA </td><td> 354210 </td><td></td></tr></tbody></table>

axon stretch growth: the mechanotransduction of neuronal growth

Während präsynaptischen Embryonalentwicklung durchlaufen neuronale Prozesse kurze Wege, ihre Ziele durch Wachstum Kegel erreichen. Im Laufe der Zeit sind neuronale Somata von ihren Axonterminalen aufgrund Skelettwachstum der Erweiterung Organismus (.; Gray, Hukkanen et al 1992 Weiss 1941) getrennt. Diese Mechanotransduktion induziert einen sekundären Modus des neuronalen Wachstums aufnehmen können kontinuierliche Dehnung des Axons (Bray 1984; Heidemann und Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al 1995;. Pfister, Iwata et al 2004).. Axon Stretch Growth (ASG) ist denkbar ein zentraler Faktor bei der Reifung von kurzen embryonalen Prozesse in der langen Nerven und weißen Substanz charakteristisch für die erwachsenen Nervensystem. Zur Untersuchung ASG in vitro, wir Bioreaktoren zu Spannungen auf dem kurzen axonalen Prozessen der neuronalen Kulturen (Loverde, Ozoka et al. 2011) gelten entwickelt. Hier betrachten wir näher die Methoden, die wir verwenden, um Bioreaktoren Vorbereitung und Durchführung ASG. Zunächst innerhalb der einzelnen Strecken Spur des Bioreaktors, sind Neurone auf einer Mikro-Manipulation Abschleppen Substrat beschichtet. Anschließend regenerieren Neurone ihre Axone Prozesse, über Wachstum Kegel-Erweiterung auf einem stationären Substrat. Schließlich ist Stretch-Wachstum durch das Abschleppen des vernickelt Zellkörper weg von der Axonterminalen haftete an der stationären Substrat durchgeführt; Rekapitulation Skelettwachstum nach Wachstum Kegel-Erweiterung. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass ASG von embryonalen Ratten Spinalganglien Neuronen in der Lage beispiellosen Wachstumsraten von bis zu 10mm/day sind, bis zu einer Länge von bis zu 10cm, während gleichzeitig was zu einer erhöhten axonalen Durchmesser (Smith, Wolf et al 2001;. Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;. Pfister, Iwata et al 2006;. Smith 2009). Dies ist in dramatischen Gegensatz zu regenerativen Wachstum Kegel-Erweiterung (in Abwesenheit von mechanischen Reizen), wo Wachstumsraten durchschnittlich 1mm/day mit erfolgreichen Regeneration begrenzt auf eine Länge von weniger als 3cm (Fu und Gordon 1997;. Pfister, Gordon et al 2011). Dementsprechend können weitere Studie von ASG helfen dysregulierten Wachstum Mechanismen, die die Regeneration Grenze in der Abwesenheit von mechanischen Reizen zu offenbaren.

Watch this Scientific Journal Video about Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth at JoVE.com

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Eine einzigartige Tissue Engineering-Methode wurde entwickelt, um zahlreiche Nervenfasern in Kultur durch Rekapitulation Axon Stretch-Growth-länglich, eine Form des Nervensystems Wachstum, wobei die Nerven in Verbindung mit dem Wachstum der sich erweiternden Körper zu verlängern.

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduktion des neuronalen Wachstums

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

axon-stretch-growth-the-mechanotransduction-of-neuronal-growth

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.8K Aufrufe.  New Jersey Institute of Technology. Eine einzigartige Tissue Engineering-Methode wurde entwickelt, um zahlreiche Nervenfasern in Kultur durch Rekapitulation Axon Stretch-Growth-länglich, eine Form des Nervensystems Wachstum, wobei die Nerven in Verbindung mit dem Wachstum der sich erweiternden Körper zu verlängern.

Serie: Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Gold Nanostar Synthesis mit einem Silver Seed vermitteltes Wachstum Methode

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Forschung

Biotechnik

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Magnet-Resonanz-Elastographie Methodik für die Beurteilung von Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts Wachstum

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, phosphorus, sulfate and trace elements that plants acquire from the soil. If we want to develop sustainable approaches to producing high crop yield, we need to better understand how the root develops, takes up a wide spectrum of nutrients, and interacts with symbiotic and pathogenic organisms. To accomplish these goals, we need to be able to explore roots in microscopic detail over time periods ranging from minutes to days.
We developed the RootChip, a polydimethylsiloxane (PDMS)- based microfluidic device, which allows us to grow and image roots from Arabidopsis seedlings while avoiding any physical stress to roots during preparation for imaging1 (Figure 1). The device contains a bifurcated channel structure featuring micromechanical valves to guide the fluid flow from solution inlets to each of the eight observation chambers2. This perfusion system allows the root microenvironment to be controlled and modified with precision and speed. The volume of the chambers is approximately 400 nl, thus requiring only minimal amounts of test solution.
Here we provide a detailed protocol for studying root biology on the RootChip using imaging-based approaches with real time resolution. Roots can be analyzed over several days using time lapse microscopy. Roots can be perfused with nutrient solutions or inhibitors, and up to eight seedlings can be analyzed in parallel. This system has the potential for a wide range of applications, including analysis of root growth in the presence or absence of chemicals, fluorescence-based analysis of gene expression, and the analysis of biosensors, e.g. FRET nanosensors3.

This article provides a protocol for cultivation of Arabidopsis seedlings in the RootChip, a microfluidic imaging platform that combines automated control of growth conditions with microscopic root monitoring and FRET-based measurement of intracellular metabolite levels.

Zeitraffer-Fluoreszenz-Imaging von Arabidopsis Wurzelwachstum mit Rapid Manipulation der Root-Umgebung mit dem RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Elektro Growth Factor Releasing Mikrosphären in Fasergerüste

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Studieren der Stöchiometrie der Epidermal Growth Factor Receptor in intakten Zellen mit korrelative Mikroskopie

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

Polyelektrolytkomplex für Heparin-Bindungsdomäne Osteogenisches Growth Factor Lieferung

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

Gestaltung von porösem Silizium Filme als Träger von Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

Wachstum und Charakterisierung der bestrahlten Organoide aus den Brustdrüsen

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and multidirectional shear stresses have all been postulated to stimulate a pro-atherosclerotic phenotype in endothelial cells, whereas high magnitude and unidirectional or uniaxial shear are thought to promote endothelial homeostasis. These hypotheses require further investigation, but traditional in vitro techniques have limitations, and are particularly poor at imposing multidirectional shear stresses on cells. 
One method that is gaining increasing use is to culture endothelial cells in standard multi-well plates on the platform of an orbital shaker; in this simple, low-cost, high-throughput and chronic method, the swirling medium produces different patterns and magnitudes of shear, including multidirectional shear, in different parts of the well. However, it has a significant limitation: cells in one region, exposed to one type of flow, may release mediators into the medium that affect cells in other parts of the well, exposed to different flows, hence distorting the apparent relation between flow and phenotype. 
Here we present an easy and affordable modification of the method that allows cells to be exposed only to specific shear stress characteristics. Cell seeding is restricted to a defined region of the well by coating the region of interest with fibronectin, followed by passivation using passivating solution. Subsequently, the plates can be swirled on the shaker, resulting in exposure of cells to well-defined shear profiles such as low magnitude multidirectional shear or high magnitude uniaxial shear, depending on their location. As before, the use of standard cell-culture plasticware allows straightforward further analysis of the cells. The modification has already allowed the demonstration of soluble mediators, released from endothelium under defined shear stress characteristics, that affect cells located elsewhere in the well.

This protocol describes a coating method to restrict endothelial cell growth to a specific region of a 6-well plate for shear stress application using the orbital shaker model.

Segmentierung des Wachstums von Endothelzellen in 6-Well-Platten auf einem Orbitalschüttler für mechanobiologische Studien

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Ein einfacher mikrofluidischer Chip für Langzeitwachstum und Bildgebung von Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...