Wir danken Dr. Kati Andreasson (Abteilung für Neurologie und neurologische Science, Stanford University) für den Einsatz der qRT-PCR-Maschine. Die Arbeit wurde durch nationale Institute der Gesundheit Stipendien K08NS098876 (zu P.M.G.) und der Stanford School of Medicine Dean Postdoctoral Fellowship (, b.o.) unterstützt.

Alle Stammzellen und tierischen Verfahren wurden von Stanfords Stem Cell Research Oversight Committee und von Stanford University Verwaltungs-Panel auf Laboratory Animal Care (SCRO-616 und APLAC-31909) genehmigt.
(1) Ätzen von ITO-Glas
<ol><li>Vorbereiten der Indium-Zinn-Oxid (ITO)-überdachte Objektträger indem man einen Maskierung-Agent über die leitende Seite des Glases. Hinweis: Die meisten kommerziellen transparente Bänder können als Maskierung Agent verwendet werden.<ol>
<li>Entfernen Sie die überschüssige Maske mit einer Klinge, so dass nur die gewünschte Form des endgültigen ITO Design auf dem Glas abgedeckt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kombinieren Sie 5 % (V/V) von Salpetersäure und 45 % (V/V) von HCl in ein Becherglas in einer Dampfhaube, Radierung Lösung vorzubereiten.<ol>
<li>Verwenden Sie eine Herdplatte und ein Thermometer, um sicherzustellen, dass die Temperatur der Radierung Lösung bei 70 ° c gehalten wird</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald die Radierung Lösung 70 ° C erreicht, legen Sie die maskiert-ITO-Glas-Folie in die Lösung für 2 Minuten, um die überschüssige ITO-Schicht zu entfernen. Hinweis: Masking Tape schützt die ITO-Schicht vor der Exposition gegenüber sauren Lösung.</li>
	<li>Entfernen Sie die Folie aus der Lösung und spülen Sie ihn mit entionisiertem (DI) H2O.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Maske und Maßnahme Widerstand mit einem Multimeter um sicherzustellen, dass die verbleibenden ITO intakt ist. Auslesen von den gewünschten geätzten Bereich sollte ungefähr 0 Ω.</li>
</ol>2. Vorbereitung des Pyrrol-Lösung
<ol><li>Lösen Sie in einem 1000-mL-Glasflasche 70 g Natrium-Dodecylbenzenesulfonate (NaDBS auf) in 600 mL DI H2O.</li>
	<li>Wenn die NaDBS aufgelöst ist, fügen Sie 14 mL 0,2 M Pyrrol und 386 mL DI H2O der Projektmappe hinzu.</li>
	<li>Die Lösung mit Alufolie abdecken und bei 4 ° c Lagern</li>
</ol>(3) Galvanik von Polypyrrol auf ITO Glas
<ol><li>Erwärmen Sie die Pyrrol-Lösung auf Raumtemperatur, bis NaDBS voll Bodensatz ist. Hinweis: Dies dauert etwa 15 bis 20 Minuten.</li>
	<li>Gießen Sie 25 mL der Pyrrol-Lösung in ein Becherglas.</li>
	<li>Das geätzte ITO-Glas mit einem Multimeter verbinden und die Folie in die Pyrrol-Lösung eintauchen.<ol>
<li>Stellen Sie sicher, dass die Seite mit 0 Ω Widerstand gegen die Bezugselektrode Platin Netz zeigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenden Sie einen elektrischen Strom um Galvanisierung von Wiedersehen auf der ITO-Oberfläche mit einem Multimeter (aktuell bei 3 mA/cm2 für 4 Stunden kontrolliert) zu initiieren.</li>
	<li>Entfernen Sie das ITO-Glas aus der multimeter und waschen galvanisiert-Wiedersehen in DI H2O, passives Tensid zu entfernen.</li>
	<li>Lösen Sie sanft die galvanisiert PPy Platte aus dem ITO Glas mit einer Rasierklinge.<ol>
<li>Lagern Sie die PPy Platte bei Raumtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Vorbereitung der Polydimethylsiloxan (PDMS)
<ol><li>Mit einem Spatel und eine Schüssel wiegen, 18 g des Basis-Agents mit 2 g härter mischen und den Teig in zwei 10 cm x 8 cm Glasformen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Luftblasen aus den Formen mit einer Vakuumkammer für 15-20 Minuten.</li>
	<li>Legen Sie die Formen in einem 70 ° C Backofen für 3 h.</li>
	<li>Sobald Sie abgekühlt, einem Spatel flach die PDMS aus den Formen entfernen.</li>
</ol>5. Herstellung von In-vitro- Elektrostimulation Kammer
<ol><li>Autoklaven die Metallplatten (WxL, 2,5 cm x 12,5 cm) und den Fluss Ventile bei 120 ° C für 1 Stunde.</li>
	<li>Schneiden Sie eine Kammer-Folie als Vorlage verwenden, zwei Stücke von PDMS. Hinweis: Einteiler des PDMS dient als der Rand der Zelle Kammer mit Ausschnitten von zwei angrenzenden Quadrate von innerhalb der Zelle Kammer. Das andere Stück PDMS ist eine Gliederung der Kammer Perimeter.<ol>
<li>Schneiden Sie das innere Zelle Kammer damit es quadratisch ist geformt und entspricht der Form der Zelle Kammer. Sicherstellen Sie, dass die allgemeine Form der beiden Stücke von PDMS rechteckig ist und der der Kammer-Folie entspricht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schicht der Materialien wie folgt von unten nach oben: (1) Metall-Platte, (2) PDMS (ohne Ausschnitte), (3) PPy Platte (senkrecht zur PDMS), (4) PDMS (mit Ausschnitten) und (5) Zelle Kammer.</li>
	<li>Klemmen Sie den Apparat zusammen, sobald sie vollständig ausgerichtet ist.</li>
	<li>Schneiden Sie zwei 60 cm Stücke aus einem Metalldraht und mit Silberpaste einen Draht an jedem Ende der PPy Platte befestigen, die von außen der Kammer ragt. Stellen Sie sicher, dass die Kabel lang genug sind, um aus der Vorrichtung an der Außenseite der Inkubator zu verlängern.</li>
	<li>Sobald die Silberpaste geheilt ist, zu verstärken und die Drahtverbindung mit Epoxidharz zu versiegeln.<ol>
<li>Notieren Sie den Widerstand mit einem Multimeter um sicherzustellen, dass das angewandte Feld das gleiche in jeder Kammer ist.</li>
		<li>Entfernen Sie für die Implantation die Kabel; muss die Zelle Kammern und PDMS und dann sie getrennt von dem leitenden Gerüst. Die Dimension der implantierten Gerüste ist ca. 1 x 3 x 0,25 mm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. plating menschlichen neuronalen Vorläuferzellen (hNPCs) auf Wiedersehen
<ol><li>Sterilisieren Sie die zusammengesetzten Kammern unter UV-Licht für 2 Stunden.<ol>
<li>Nach 1 Stunde, drehen Sie den versammelten Kammern 90°.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach Sterilisation Mantel der Oberfläche der PPy an der Unterseite der Kammer mit 800 µL eines Substrats, Beschichtung und das Substrat, auf Wiedersehen-Platte in einem Inkubator bei 37 ° C um 5 % CO2 für 1 h zu festigen.</li>
	<li>Entfernen Sie nach 1 Stunde den überstand von Kammern und sanft Spülen mit 1 mL des DPBS + Ca + Mg pro Bohrloch. Hinweis: Vermeiden Sie, waschen die Oberfläche des PPy mit Nachdruck als die Ablösung des Substrats Beschichtung dadurch.</li>
	<li>Trennen Sie mit Frischzellen-Media, mechanisch kultivierte Zellen für den Einsatz mit den Kammern aus einer Gewebekultur-Platte mit sanften pipettieren. Hinweis: Zellen sollte 90-100 % Zusammenfluss bei Dissoziation.</li>
	<li>Sammeln Sie hNPC Pellets mit Zentrifugation bei 8000 X g für 5 Minuten.</li>
	<li>Mit einer Hemocytometer, zählen und Aufschwemmen der Zellen bei einem Volumen von 100.000 Zellen/cm2.</li>
	<li>Platte 100.000 Zellen in jeder Kammer gut (100.000 Zellen/cm2 in 1 mL der Medien).</li>
	<li>Zurück Kammern zum Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2.
</li>
</ol>7. die elektrische Stimulation von hNPCs
<ol><li>Einen Tag nach der Aussaat verwenden die Zellen auf die Kammern einen Wellenform-Generator elektrischen Stimulation der Zellen anwenden.</li>
	<li>Vor Stimulation auch jede Kammer alte Medien entnehmen und mit 800 µL frische Medien ergänzen.</li>
	<li>Nachdem die Medien geändert werden, setzen Sie die Kammern wieder in den Inkubator, erweitern Sie die Drähte aus dem Inkubator und bringen Sie sie zu einem Waveform-generator</li>
	<li>Wenden Sie die Stimulation auf die Zellen mit einem Rechtecksignal bei ±400 mV mit 100 Hz für 1 h.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Stimulation die Kabel und inkubieren Sie die Kammern für einen weiteren Tag im Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2eingestellt.</li>
	<li>Führen Sie nachfolgende biologische Analyse einschließlich Zellviabilität und quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) nach der Hersteller-Protokolls.</li>
</ol>8. in Vivo PPy Implantation
<ol><li>Führen Sie distale mittlere zerebrale Arterie (dMCA) Okklusion Schlaganfall Modelle auf T-Zell-defizienten Erwachsene männlichen nackte Ratten (NIH-RNU 230 ± 30 g) wie zuvor beschrieben2. Durchführen Sie Implantation einer Woche Post-dMCA Okklusion.</li>
	<li>Geben Sie einen Tag vor der Operation Ampicillin (1 mg/mL), die Ratten in ihrem Käfig Wasser.</li>
	<li>Betäuben Sie die Ratte in eine Induktion Kammer mit 0,5 - 3 % mg/kg Isofluran per Inhalation verabreicht.</li>
	<li>Bestätigen Sie Anesthetization der Ratte durch einen Mangel an Zehe Prise reflex Antwort.<ol>
<li>Während das Tier in Narkose ist, weiterhin seine Membran Farbe, Atmung und rektale Temperatur überwachen alle 15 Minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald Anesthetization bestätigt wurde, gelten Sie künstliche Tränen in Augen der Ratte um Trockenheit zu verhindern.</li>
	<li>Sicherstellen Sie, dass aseptischer Technik während dieses Verfahrens beibehalten wird, mithilfe von sterilen Handschuhen und ein steriles op-Tuch-13. Halten Sie sterile chirurgische Instrumente in einem sterilen Bereich.</li>
	<li>Während die Ratte unter Narkose ist, Bohren Sie ein kraniektomien oberhalb der linken Cortex. Öffnen Sie die Dura.<ol>
<li>Die Dura Mater aus dem Gehirn mit einer Mikro-dünne chirurgische Nadel zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Implantat-leitfähige Gerüste aus in-vitro- System auf die Ratte Kortex. Hinweis: Für unsere Experimente implantiert wir Gerüste von in-vitro- Tag 3 nach hNPC Beschichtung.<ol>
<li>Legen Sie das Implantat in erster Linie auf der Halbschattenphase Kortex medial der Schlaganfall-Läsion.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nachdem das Gerüst platziert ist, legen Sie Surgicel über dem Implantat, Bewegung mit Haut-Verschluss zu verhindern.</li>
	<li>Naht die Wunde geschlossen und subkutan injizieren die Ratten mit Buprenorphin SR in einer Dosierung von 1 mg/kg, die Schmerzen im Zusammenhang mit der stereotaktischen Chirurgie und dMCA Okklusion zu verwalten.</li>
	<li>Legen Sie die Ratte in einem Käfig Erholung, wie es das Bewusstsein wiedererlangt.<ol>
<li>Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt während er bewusstlos ist.</li>
		<li>Legen Sie das Tier mit anderen nicht, bis es vollständig Bewusstsein erlangt hat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beobachten Sie Tiere täglich auf Anzeichen von Schmerzen einschließlich Körper Gewichtsverlust, verminderte Essen/Wasseraufnahme, reduzierte Pflege/ungepflegten Mantel, spontane Aktivität verringert/erhöht, abnorme Körperhaltung, Dehydrierung/Haut Zelten, eingefallenen Augen, versteckt, Selbstverstümmelung, schnelle Atmung, offenen Mund atmen, Zuckungen, Zittern, Tremor und Vokalisation.<ol>
<li>Beobachten Sie die Tiere täglich bis es erscheint, dass sie essen, trinken, Pflege, und Gewichtszunahme; und dann wöchentlich nach Gewicht zu gewinnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Frühen Euthanization über CO2 Inhalation und eine sekundäre Bestätigung des Euthanization (um sicherzustellen, das Tier wird nicht durch normale Versorgung Post CO2 Sauerstoffinhalation wieder beleben) erfolgt für jedes Tier, das scheint nicht zu essen, trinken und Gewichtszunahme nach dem ersten chirurgischen Eingriff; erscheint in Schmerz; oder erscheint nicht in der Lage, die Verhaltensstörungen Tests durch eine größer als motorische Kortex Defizit erwartet abgeschlossen.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, mit dieser Arbeit zu erklären.

Immer mehr Hinweise hat das Versprechen von Stammzellen als eine neuartige Schlaganfall-Therapie gezeigt. Dieses Versprechen führte eine Hauptbemühung, Stammzell-Therapie um das Krankenbett mit mindestens 40 laufenden oder abgeschlossenen klinischen Studien zu gelangen. Schlaganfall-Pathologie bietet eine einzigartige neurologische Störung, die eignet sich für Stammzell-Therapie, weil nach der akuten Beleidigung gibt es keine Neurodegenerative Prozess, d.h. die Wiederherstellung. Der genaue Mechanismus der Stammzellen erhöht Schlaganfall Erholung bleibt unklar. Angiogenese, Synaptogenese und synaptischen Umbau nachweislich alle wichtig sein. Wenn wichtige Moleküle für Synapse Bildung wie BDNF und THBS-1 entfernt werden, ist Schlaganfall Erholung beeinträchtigt6,19. hNPCs verbesserten funktionellen Erholung nach Schlaganfall in zahlreichen Tiermodellen20,21. Die Mechanismen der hNPCs Wirkung noch nicht vollständig verstanden, und die ideale Versandart für diese Zellen ist unbekannt. Durch die Entwicklung eines Systems, das es erlaubt, wichtige Moleküle, die aus dem hNPCs entlassen zu manipulieren, kann einer helfen die integrale Wiederherstellungsmechanismen differenzieren und optimieren Stammzell-Therapie.
Erfolgreiche Zelle Lieferung an das Gehirn bleibt eine Herausforderung. Derzeit haben eine Reihe von Technologien entwickelt, mit verschiedenen Biomaterial-Gerüst-Systeme liefern Stammzellen um das Überleben und die Integration von Stammzellen9,10zu verbessern. Aufgrund der inerten Eigenschaften dieser Materialien ist es jedoch schwierig, Stammzellen nach ihrer Transplantation zu modulieren.
Dieser Artikel beschreibt eine Methode mit einem Wiedersehen Gerüst, um das Transkriptom des hNPCs elektrisch zu manipulieren, dargestellt durch die Hochregulierung des BDNF und THBS-1 in unserem qRT-PCR-Daten. Unsere früheren Studie ergab, dass eine Erhöhung VEGFA Expression auf hNPCs nach Belastung durch elektrische Stimulation funktionelle Erholung nach Schlaganfall2verbessert. Hier zeigen wir, dass dieser zusätzliche neurotrophen Faktoren wie BDNF und THBS-1 auch moduliert werden nach Belastung durch elektrische Stimulation in einer unterschiedlichen hNPC Zelllinie zeigen, dass unser System mit zahlreichen Zelllinien verwendet werden kann.
Während der Herstellung der in-vitro- Elektrostimulation Kammer ist es wichtig, dass der Metalldraht komplett mit PPy Platte mit Silberfarbe und Epoxy verbunden ist. Wenn diese Verbindung nicht gesund ist, bewirkt, dass es unterschiedliche elektrische Felder sogar mit den gleichen Parametern. Darüber hinaus können zeitweise Medien nach der Montage das Gerüstsystem austreten. Um dieses Problem zu beheben, kann Vakuum Fett angewendet werden, um den Abstand zwischen dem PDMS und PPy Platte mit Sorgfalt nicht anzuwenden auf die Zelle-säen Oberfläche zu versiegeln. Eine Einschränkung aufgrund der undurchsichtigen PPy Platte ist, dass Check-Cells Konfluenz mit standard Lichtmikroskopie begrenzt ist.
Der Vorteil der in diesem Protokoll beschriebenen Methode ermöglicht Modulation des hNPCs um die mechanistischen Änderungen der Zellen zu ermitteln. Derzeit hat elektrische Modulation nicht mit herkömmlichen Hydrogel oder inerten Gerüstsysteme genähert. Nach der elektrischen Stimulation mit dem Wiedersehen Gerüst können die hNPCs ohne Entnahme aus der Polymer-Oberfläche zu einem in-Vivo -Modell geliefert werden. Entwicklung von Methoden, Krankheitsmodelle Stammzell-Anwendungen weiter zu studieren ermöglicht es, besseres Design translationale Anwendungen. Der elektrische preconditioning Ansatz, ermöglicht durch die leitfähige Polymer-System kann auf verschiedene Zelltypen angewendet werden und ermöglicht für ein besseres Verständnis der Auswirkungen der Elektrostimulation auf eine Zelle. Die Möglichkeit, Zellen in Vitro zu optimieren und dann ohne weitere Manipulation (z. B. passagierung oder Entfernung) zur Prüfung von diesen in-vitro- Manipulationen bei in Vivo Krankheitszuständen wie Schlaganfall. Das ultimative Ziel ist, neue Techniken, wie der beschriebenen leitfähiges Polymer Gerüst, Schlaganfall-Therapie und Verbesserung des Verständnisses der Schlaganfall Wiederherstellungsmechanismen zu nutzen.

Der Schlaganfall ist die zweithäufigste Ursache des Todes in der Welt und die fünfthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten. Trotz dieser hohen Todesraten bleiben Behandlungen für Schlaganfall Erholung derzeit eine Herausforderung mit derzeit keine praktikable medizinische Möglichkeiten1. Derzeit gibt es über 300 klinische Studien, die der Umgang mit ischämischen Schlaganfällen, von denen nur 40 Stammzellen nutzen. Frühere Studien haben gezeigt, dass Stammzell-Therapien eine positive Wirkung auf Schlaganfall Reparatur2,3 haben. Parakrine Faktoren wie Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF) und Thrombospondin-1 (THBS-1) von transplantierten menschliche neurale Vorläuferzellen (hNPCs) freigegeben haben verbesserte Funktionelle Wiederherstellung durch Mechanismen verbunden mit einer Zunahme gezeigt. Synapse, Bildung, Angiogenese, dendritische Verzweigung und neue axonalen Projektionen sowie modulieren das Immunsystem4,5,6. Die optimalen Methoden der Stammzellen bleiben jedoch schwer.
Erfolgreiche Stammzell-Lieferung an das Gehirn bleibt eine Herausforderung. Derzeit, wurden injizierbaren Hydrogel und Polymere Gerüst-Systeme eingeführt, um Stammzellen zu liefern. Diese Liefermethoden schützen Stammzellen während der Transplantation sowie bieten Schutz vor der rauen nach Schlaganfall-Umgebung, einschließlich des Gastgebers Entzündungsreaktion und hypoxischen Bedingungen7,8,9 , 10. jedoch die am häufigsten verwendeten Materialien sind inert, die schränkt die Verwendung von kontinuierlichen Modulation (d.h. elektrische Stimulation) der Zellen11. Elektrostimulation ist ein Stichwort, der Differenzierung, Kanal Ionendichte und Neurit Auswuchs der Stammzellen12beeinflusst. Im Vergleich zu inerten Polymeren können leitfähige Polymeren tragen ein aktueller erlaubt für elektrische Stimulation und Manipulation von Stammzellen2. Der genaue Mechanismus, durch den elektrischer Stimulation Neurotrophic Factor Release (z.B. BDNF und THBS-1) moduliert, ist jedoch noch nicht vollständig erforscht.
In diesem Protokoll beschreiben wir die Schritte, um ein Zellkultursystem bestehend aus leski leitfähiges Polymer Polypyrrol (PPy), die für in-vitro- elektrische Stimulation ermöglicht zu konstruieren. Aufgrund der Art und Weise, in der das Zellkultursystem hergestellt wird, ist die spätere Implantation von Stammzellen entkernt Gerüst auf der Peri-Infarkt Kortex möglich. Für dieses System Voraussetzung wir elektrisch Stammzellen auf dem Gerüst für einen kurzen Zeitraum vor der Implantation. Im Anschluss an elektrische Stimulation wird das leitfähige Polymer Gerüst tragen die Zellen erfolgreich implantiert intracranially mit einer minimal-invasive Methode.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="623">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">FGF-Basic</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">CTP0261</td>
			<td style="width:188px;">20 ng/mL for working media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Matrigel</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">cb40234a</td>
			<td style="width:188px;">1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:213px;">LIF Protein, Recom. Hum. (10 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:103px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">LIF1010</td>
			<td style="width:188px;">10 ng/mL for working media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Sylgard 184 silicone 3.9 kg</td>
			<td style="width:103px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">NC0162601</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:103px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">SA56-4</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:213px;">Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical</td>
			<td style="width:103px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">SA95</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">ITO Glass</td>
			<td style="width:103px;">Delta Technologies</td>
			<td style="width:119px;">CG-40IN-0115</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">Sodium dodecylbenzenesulfonate</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">289957-1KG</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:213px;">Pyrrole</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">131709-500ML</td>
			<td style="width:188px;">Protect pyrrole solution from light and room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:213px;">8 well glass slide chambers</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Sci Nuc&#160;</td>
			<td style="width:119px;">125658</td>
			<td style="width:188px;">Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">Flat-Surface Bracket, 3&#34;x1&#34;</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1030A4</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:213px;">TWO PART SILVER PAINT 14G</td>
			<td style="width:103px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1264214</td>
			<td style="width:188px;">Mix two parts (1:1) in plastic plate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red</td>
			<td style="width:103px;">Genesse&#160;</td>
			<td style="width:119px;">25-508C</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit</td>
			<td style="width:103px;">Aruna Biomedical&#160;</td>
			<td style="width:119px;">ABNS7013.2</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit</td>
			<td style="width:103px;">Aruna Biomedical&#160;</td>
			<td style="width:119px;">&#160;hNP7013.1</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:213px;">Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32&#34; to 5/8&#34; Tube OD</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5330K22</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Multimeter</td>
			<td style="width:103px;">Keysight&#160;</td>
			<td style="width:119px;">E3641A</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">Wavefoam generator</td>
			<td style="width:103px;">Keysight</td>
			<td style="width:119px;">33210A-10MHz</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">Pt meshes</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">298107-425MG</td>
			<td style="width:188px;">Reference electrode with dimensions, 1x1 cm</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:213px;">LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:213px;">BDNF</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Hs02718934_s1</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">THBS1</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Hs00962908_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:213px;">GAPDH</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Hs02758991_g1</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">RNeasy Mini Kit (250)</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74106</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">QIAshredder (250)</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79656</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">RNase-Free DNase Set (50)</td>
			<td style="width:103px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">79254</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:213px;">iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 &#181;L rxns</td>
			<td style="width:103px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;">1708891</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:213px;">TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">4369510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:213px;">7-8 Week Old, male, RNU Rats</td>
			<td style="width:103px;">NCI-Frederick</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:213px;">4-0 Ethicon Silk Suture</td>
			<td style="width:103px;">eSutures.com</td>
			<td style="width:119px;">683G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:103px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:213px;">V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System</td>
			<td style="width:103px;">VetEquip</td>
			<td style="width:119px;">901806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:213px;">Surgicel Original Absorbable Hemostat</td>
			<td style="width:103px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">1952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat</td>
			<td style="width:103px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">51600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:213px;">Kimberly-Clark Professional&#160;Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves</td>
			<td style="width:103px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">19-063-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Sterile Drape</td>
			<td style="width:103px;">Medline</td>
			<td style="width:119px;">DYNJSD1092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:213px;">Thermo Scientific&#160;Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades</td>
			<td style="width:103px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">53-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">Walter Stern Scalpel Blade Series 300</td>
			<td style="width:103px;">Fisherbrand</td>
			<td>17-654-456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:213px;">QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4484642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:213px;">Frazier Micro Dissecting Hook</td>
			<td style="width:103px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>52-2706</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrically conductive scaffold to modulate and deliver stem cells

Stammzell-Therapie ist als eine spannende Schlaganfall therapeutische aufgetaucht, aber die optimale Versandart bleibt unklar. Während die Technik der Mikroinjektion jahrzehntelang verwendet wurde, um Stammzellen in Takt Modelle liefern, wird diese Technik durch die mangelnde Fähigkeit der Stammzellen vor der Injektion zu manipulieren begrenzt. Dieses Dokument beschreibt eine Methode mit einem elektrisch leitfähigen Polymer Gerüst für Stammzell-Lieferung. Die elektrische Stimulation von Zellen mit einem leitfähigen Polymer Gerüst verändert die Stammzelle Gene, die in Zelle überleben, entzündliche Reaktion und synaptischen Umbau. Nach der elektrischen Vorkonditionierung, sind die Stammzellen auf dem Schafott intracranially in einem Rattenmodell distale mittlere zerebrale Arterie Okklusion transplantiert. Dieses Protokoll beschreibt eine leistungsfähige Technik um Stammzellen über ein leitfähiges Polymer Gerüst zu manipulieren und schafft ein neues Tool zur Stammzell-Therapie weiter zu entwickeln.

In Abbildung 1 gezeigten Schaltplan repräsentiert den gesamten Arbeitsablauf der elektrischen Stimulation des hNPCs und mögliche downstream-Anwendungen. Eine Strombegrenzung in Stammzell-Therapie ist, dass Stammzellen nach Transplantation Umgebungen einschließlich Entzündungen und ischämischen Bedingungen ausgesetzt sind. Diese schwierigen Bedingungen wahrscheinlich begrenzen ihre therapeutische Wirksamkeit14,15. Die Verwendung von leitfähigen leski, hNPCs aus diesem Umfeld zu schützen kann hNPCs therapeutische Vorteile durch elektrische Vorkonditionierung ergänzen. Der erste Schritt in diese Stammzellen-Lieferung-Technik ist die Entwicklung einer leitfähigen Gerüst mit einer galvanischen Ansatz2,16. Wir zeichnen sich die Gerüste Biokompatibilität und elektrische Vorkonditionierung Eigenschaften mit hNPCs optimiert. Kontrollen wurden definiert als unstimulierte Stammzellen auf einer Gewebekultur Platte gewachsen.
Verschiedene Spannungen wurden ausgewertet, um die Sicherheit der elektrischen Stimulation zu bestimmen und die preconditioning Wirksamkeit zu maximieren. Um sicherzustellen, dass das angewandte Feld gleichen in jeder Kammer, wurde der Widerstand der versammelten Kammer mit einem Multimeter gemessen (Widerstände (Ohm, Ω) der Kammern waren ca. 10 kΩ und resistivity≈3 Ωm). Nach der kommerziellen Anbieter haben die hNPCs verwendet keine signifikante Cytotoxizität in normalen Kultur Systeme gezeigt. hNPCs mit oder ohne Belastung durch elektrische Stimulation waren voller Flecken mit Zelle Lebensfähigkeit Assays (Live: grün; Dead: rot) (Abbildung 2). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass hNPCs nach der elektrischen Stimulation (±400 mV, 100 Hz für 1 h) lebensfähig waren. Um die Zelle Lebensfähigkeit Assay zu überprüfen, haben wir die Zelle Lebensfähigkeit Tests mit einem Resazurin-Assay durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen auch keine signifikanten Zytotoxizität der elektrischen Stimulation auf hNPCs.
Unsere bisherigen in-Vivo -Daten zeigten, dass Parakrine Faktoren veröffentlicht von hNPCs (SD56, abgeleitet aus embryonalen Stammzellen NPCs) mit einer Exposition gegenüber elektrischen Stimulation die Erholung nach Schlaganfall2verbessern. Um weiter zu erforschen Kandidat Faktoren bekannt, dass Schlaganfall Erholung wichtig sein, die freigegeben werden aus hNPC (Biomedizinische Aruna, NPCs aus embryonalen Stammzellen abgeleitet), wurden BDNF und THBS-1 bewertet. Diese Faktoren wurden wegen ihrer Rolle in der neuronalen Auswuchs ausgiebig untersucht und Steigerung der Zell-Zell-Interaktionen17,18. Um die Wirksamkeit der Elektrostimulation auf Transkriptom Änderungen für BDNF und THBS-1 zu untersuchen, wurde qRT-PCR durchgeführt, einschließlich BDNF und THBS-1 Gene mit GAPDH als Zimmermädchen gen. Ca. 1 µg Gesamt-RNA wurde umgekehrt in cDNA laut Protokoll des Herstellers transkribiert. Normalisierte Falte-Änderung-Verhältnisse wurden durch ΔΔCt Methode vergleicht Genexpression in hNPCs auf Wiedersehen und hNPCs auf Wiedersehen mit einer Exposition gegenüber elektrischen Stimulation berechnet. Statistische Analyse zeigte deutliche Upregulations in der Genexpression von BDNF und THBS-1 zwischen Gruppen, die elektrisch Stimulation abhängig (p ≤0.01) waren (Abbildung 3). Diese Daten deuten darauf hin, dass Optimierung ist möglich, hNPC Wirksamkeit ohne signifikante Zelltod zu maximieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57367/57367fig1.jpg"> Abbildung 1 . In-vitro- leitfähigen Polymer Gerüst System für elektrische Stimulation. (A) eine Folie Kammer auf Wiedersehen Platte platziert ist. (B) der Schaltplan zeigt die Herstellung von in-vitro- Elektrostimulation Kammer mit hNPCs auf der Oberfläche des PPy vernickelt. Flow Ventile dienen zum halten der Folie Kammer, PDMS, Wiedersehen, und Metallplatte zusammen. (C) Bild der Kammer. <a href="/files/ftp_upload/57367/57367fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57367/57367fig2.jpg"> Abbildung 2 . Zelle Lebensfähigkeit in hNPCs mit oder ohne elektrische Stimulation Assay. (A) Balkendiagramm zeigt live Zelle mit Calcein-am befleckt. Daten, die dargestellt sind Mittelwert ± S.D.; n = 4. (B) Zelle Lebensfähigkeit Assay mit Resazurin. Balkendiagramm zeigt, gab es keine Zytotoxizität der elektrischen Stimulation auf hNPCs; n = 4. (C) Bilder der Zellviabilität Test vor und nach der Reizstrom Behandlung. Grünes Signal zeigt an lebenden Zellen (Calcein-am), während rotes Signal, abgestorbenen Zellen (EtHD-1 anzeigt). ES gibt elektrischen Stimulation. ES + oder - zeigt das Vorhandensein oder Fehlen der elektrischen Stimulation auf Zellen. <a href="/files/ftp_upload/57367/57367fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57367/57367fig3.jpg"> Abbildung 3 . Veränderungen der Genexpression mit elektrischer Stimulation. Balkendiagramm zeigt Falten Änderungen in gen Ausdrücken von BDNF (A) und THBS1 (B) in hNPCs (** zeigt statistisch signifikant zwischen elektrisch vorkonditionierten und alle anderen Gruppen, p < 0,01, Fehler Bars zeigen S.D.; n = 4, einfache ANOVA ). Negativer Wert gibt an das Steuerelement wo Zellen auf einem Teller regelmäßige Gewebekultur gezüchtet wurden. ES + oder - zeigt das Vorhandensein oder Fehlen der elektrischen Stimulation auf Zellen. <a href="/files/ftp_upload/57367/57367fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Electrically Conductive Scaffold to Modulate and Deliver Stem Cells

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von einem Zellkultursystem zu ermöglichen, Aussaat von Stammzellen auf einem leitfähigen Polymer Gerüst für in-vitro- elektrische Stimulation und anschließende in Vivo Implantation von Stammzellen entkernt Gerüst mit einer minimal-invasive Technik.

Elektrisch leitfähige Gerüst zu modulieren und Stammzellen liefern

Stem cell therapy has emerged as an exciting stroke therapeutic, but the optimal delivery method remains unclear. While the technique of microinjection ...

electrically-conductive-scaffold-to-modulate-and-deliver-stem-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.3K Aufrufe.  Stanford University School of Medicine. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von einem Zellkultursystem zu ermöglichen, Aussaat von Stammzellen auf einem leitfähigen Polymer Gerüst für in-vitro- elektrische Stimulation und anschließende in Vivo Implantation von Stammzellen entkernt Gerüst mit einer minimal-invasive Technik.

Serie: Electrically Conductive Scaffold to Modulate and Deliver Stem Cells

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

Planar-und Drei-Dimensional Printing von Leitfähige Druckfarben

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Forschung

Biotechnik

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Entwicklung, Erweiterung und<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Bestellen Einzelzellen und Einzel Embryos in 3D Confinement: Ein neues Gerät für High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only one-fourth of these patients achieving transplantation, there is a dire need for alternatives for those with failing organs. In order to decrease the harmful consequences of dialysis along with the overall healthcare costs it incurs, active investigation is ongoing in search of alternative solutions to organ transplantation. Implantable tissue-engineered renal cellular constructs are one such feasible approach to replacing lost renal functionality. Here, described for the first time, is the microdissection of murine kidneys for isolation of living corticomedullary renal segments. These segments are capable of rapid incorporation within scaffold-free endothelial-fibroblast constructs which may enable rapid connection with host vasculature once implanted. Adult mouse kidneys were procured from living donors, followed by stereoscope microdissection to obtain renal segments 200 - 300 &#181;m in diameter. Multiple renal constructs were fabricated using primary renal segments harvested from only one kidney. This method demonstrates a procedure which could salvage functional renal tissue from organs that would otherwise be discarded.

Tissue-engineered renal constructs provide a solution for the organ shortage and deleterious effects of dialysis. Here, we describe a protocol to micro dissect murine kidneys for isolation of cortico-medullary segments. These segments are implanted into scaffold-free cellular constructs, forming renal organoids.

Mikrodissektion primäre renale Gewebe Segmente und Einbindung mit neuartigen Gerüst-freie Konstrukt-Technologie

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates after injection into injured tissues as well as the observed massive cell death rates lead to very restricted therapeutic effects. To overcome these limitations, we sought to establish a non-viral based protocol for suitable cell engineering prior to their administration. The modification of human CD133+ expressing SCs using microRNA (miR) loaded magnetic polyplexes was addressed with respect to uptake efficiency and safety as well as the targeting potential of the cells. Relying on our protocol, we can achieve high miR uptake rates of 80&#8211;90% while the CD133+ stem cell properties remain unaffected. Moreover, these modified cells offer the option of magnetic targeting. We describe here a safe and highly efficient procedure for the modification of CD133+ SCs. We expect this approach to provide a standard technology for optimization of therapeutic stem cell effects and for monitoring of the administered cell product via magnetic resonance imaging (MRI).

This protocol illustrates a safe and efficient procedure to modify CD133+ hematopoietic stem cells. The presented non-viral, magnetic polyplex-based approach may provide a basis for the optimization of therapeutic stem cell effects as well as for monitoring the administered cell product via magnetic resonance imaging.

Protokoll für MicroRNA Transfer an adulten Knochenmark gewonnenen Hämatopoetischen Stammzellen Zelle Engineering kombiniert mit magnetischen Ausrichtung ermöglichen

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

Eine Kulturmethode zur Erhaltung von quiescent Human Hematopoietic Stammzellen

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...