Um die exquisite natürliche Ultrastruktur von Zellen zu beobachten, ist es notwendig, Zellen durch schnelles Einfrieren zu fixieren. Das Einfrieren von Sandwiches ist eine der besten Methoden, um Zellen einzufrieren, ohne Eiskristalle zu bilden. Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung von Sandwich-Gefriervorrichtungen und beschreibt auch das Verfahren zur Herstellung ultradünner Abschnitte von gefriersubstituierten Proben nach dem Einfrieren von Sandwiches.
Beginnen Sie mit der Zubereitung von flüssigem Propan, indem Sie den Behälter für flüssigen Stickstoff des Sandwich-Gefriergeräts oder SFD mit flüssigem Stickstoff füllen. Füllen Sie den flüssigen Propanbehälter mit flüssigem Propan, indem Sie Propangas mit einer feinen Düse einführen. Beschleunigen Sie die Erstarrung von Propan durch die Verwendung einer gekühlten Metallstange.
Um die Flach- und Korb-Kupferscheiben vorzubereiten, legen Sie sie auf einen Glasträger ohne Buchstabenseite nach oben und behandeln Sie sie mit einer Glimmentladung bei 10 Pascal, 400 Volt, einem Milliampere für 30 Sekunden, um die Scheibenoberfläche mit einem Ionenspottergerät hydrophil zu machen. Die Zellsuspension in ein Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen und bei 2.900 mal G für 10 Sekunden bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet, um eine dicke Suspension zu erhalten.
Geben Sie eine kleine Menge oder etwa 0,02 Mikroliter der Zellsuspension auf eine Kupferscheibe. Decken Sie es mit einer weiteren Kupferscheibe ab und heben Sie die Discs mit einer Pinzette auf. Machen Sie einen Brunnen in der Mitte des festen Propans mit der dünnen Metallstange.
Stellen Sie die Pinzette in eine SFD und frieren Sie sie schnell ein, indem Sie den Injektionsknopf des Geräts drücken. Weichen Sie die verwendete Pinzette in Wasser bei Raumtemperatur ein, um sie zu erwärmen, um die folgenden Proben einzufrieren. Verwenden Sie tierisches und menschliches Gewebe, das in 2,5% Glutaraldehyd, 0,1 molarem Phosphatpuffer von pH 7,4 fixiert ist.
Schneiden Sie sie mit einer Rasierklinge unter einem Stereomikroskop in 0,1 bis 0,2 Millimeter dicke Abschnitte. Legen Sie einen kleinen Tropfen der Glutaraldehydlösung auf die Kupferscheibe vom Korbtyp, dann verwenden Sie eine Pinzette, um ein Stück Gewebe in das Glutaraldehyd auf die Kupferscheibe zu legen und es mit der flachen Kupferscheibe zu bedecken. Frieren Sie die Bandscheiben schnell mit den Geweben im schmelzenden Propan der SFD ein, wie zuvor gezeigt.
Die Scheiben in einem Arbeitsbad in flüssigen Stickstoff überführen. Lösen Sie mit einer mit flüssigem Stickstoff gekühlten Pinzette die Scheiben voneinander, um die Probe freizulegen. Legen Sie die Scheiben mit den Zellen in eine Glasfläschchen, die mit einem Milliliter Aceton gefüllt ist, das 2% Osmiumtetroxid enthält, das in flüssigen Stickstoff gegeben und erstarrt ist.
Die Scheiben in einen Tiefkühlschrank geben und zwei bis vier Tage bei minus 80 Grad Celsius halten, um die Zellen einzufrieren. Bringen Sie die Proben allmählich auf Raumtemperatur, indem Sie sie zwei Stunden bei minus 20 Grad Celsius, zwei Stunden bei vier Grad Celsius und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Übertragen Sie die Scheiben auf zwei Milliliter Kunststoffröhrchen, die mit einem Milliliter Aceton gefüllt sind.
Bereiten Sie Epoxidharz vor, indem Sie die Reagenzien in einem Einwegbehälter aus Kunststoff mit einem Rührer mischen. Tauschen Sie das Aceton nacheinander mit 30% Harz in Aceton, 60% Harz und 90% Harz bei Raumtemperatur für jeweils eine Stunde aus, dann tauschen Sie das 90% Harz über Nacht mit 100% Harz bei 37 Grad Celsius aus. Zum Schluss betten Sie die Proben in 100% Harz in die Silikoneinbettungsform ein und polymerisieren Sie sie bei 60 Grad Celsius für 24 Stunden.
Nehmen Sie die polymerisierten Blöcke aus den Silikoneinbettungsformen heraus und schreiben Sie die Probennummer auf den Block. Entfernen Sie die Kupferscheiben mit einer Rasierklinge aus dem Block und schneiden Sie die auf der Blockoberfläche eingebetteten Proben mit einer Ultraschall-Trimmklinge und Rasierklingen unter einem Stereomikroskop ab. Als nächstes kleben Sie Klebeband auf das Probenblockfutter und den Probenhalter des Mikrotoms und schneiden Sie das Band an der Grenze ab.
Entfernen Sie den Block vom Ultramikrotom, setzen Sie ihn in ein Stereomikroskop und schneiden Sie ihn mit einer Rasierklinge weiter auf 0,2 x 0,3 Millimeter zu. Tragen Sie Neopren auf die Gitter auf, um sie klebrig zu machen. Setzen Sie den Block wieder auf das Ultra-Mikrotom, indem Sie die abgeklebten Teile ausrichten.
Decken Sie das Ultramikrotom mit einer Kunststoffabdeckung ab und schneiden Sie 50 bis 70 Nanometer dicke Abschnitte. Rufen Sie die Abschnitte mithilfe einer Schleife ab. Montieren Sie sie auf 300 oder 400 Mesh Kupfergittern, die mit Neopren behandelt wurden, und trocknen Sie sie.
Setzen Sie die Gitter mit Abschnitten in die Nut des halben Silikonschlauchs. Weichen Sie die Proben drei Minuten lang in Uranylacetatlösung ein. Sammeln Sie die verwendete Uranyllösung und bewahren Sie sie in einer Spritze auf.
Waschen Sie die Proben in einem halben Röhrchen mit einem Wasserstrahl und tränken Sie die Proben dann drei Minuten lang in Bleicitrat. Legen Sie bei Hefe- und Pilzproben die Gitter auf ein Filterpapier, nehmen Sie sie mit einer Pinzette auf und bedecken Sie sie mit plasmapolymerisiertem Naphthalinfilm auf der Wasseroberfläche. Stecken Sie die Gitter in den Probenhalter eines Elektronenmikroskops, dann stecken Sie den Probenhalter in das Elektronenmikroskop und beobachten Sie bei 100 Kilovolt.
Ultradünne Schnitte von E.coli und S.cerevisiae zeigten, wenn sie unter dem Elektronenmikroskop beobachtet wurden, eine natürliche Morphologie und klare Bilder. Ultradünne Schnitte von kultivierten Zellen, die mit SFD schnell eingefroren wurden, wurden unter dem Elektronenmikroskop beobachtet. Die Bilder von ultradünnen Abschnitten der menschlichen Haut waren sehr klar und zeigten eine natürliche Morphologie.
Die Kernpartikel des Hepatitis-B-Virus wurden schnell mit SFD eingefroren und durch Kryoelektronenmikroskopie beobachtet. Das Wichtigste, woran Sie sich erinnern sollten, ist, dass Sie eine sehr kleine Menge an Zellen auf die Kupferscheiben auftragen sollten, damit die Bildung von Eiskristallen beim Einfrieren verhindert wird. Durch die vorherige Fixierung tierischer Gewebe mit Glutaraldehyd wird ein gutes Einfrieren in einer Tiefe von etwa 200 Mikrometern erreicht, ähnlich der Tiefe, die durch Hochdruckgefrieren erreicht wird.
Diese Technik ebnet einem Forscher den Weg, die exquisite natürliche Ultrastruktur von Zellen leicht und kostengünstig zu beobachten.
