Unser Protokoll nutzt die lokale Verabreichung des natürlich vorkommenden hemmenden Neurotransmitters GABA mit einem sehr neuartigen Gerät, das eine neue Lösung bei der Behandlung von epileptischen Anfällen vorschlagen könnte. Die mikroaerophile Ionenpumpe ermöglicht es uns, genau zu kontrollieren, wann und wo wir Medikamente liefern. Die elektrophoretische Abgabe mit Gefädel konnte auf andere neurologische Erkrankungen abgestimmt werden.
Ein weiterer Vorteil dieser Arzneimittelabgabe-Technik ist, dass es eine sehr vernachlässigbare Druckerhöhung an der Medikamentenabgabe-Steckdose gibt, weil es keine Flüssigkeit gibt, die tatsächlich geliefert wird. Vielmehr sind es nur die Wirkstoffmoleküle selbst. Da eine enge Lokalisierung der Sonden das größte Problem darstellen wird, ist es sehr wichtig, ihre Ausrichtungswinkel und Positionierung mit Dummy-Sonden im stereotaxic-Rahmen zu testen.
Beginnen Sie mit der Befestigung des Kopfes einer anästhesierten Maus in einem stereotaxic Rahmen und mit einer 30-Spur-Nadel, um ein lokales Analgetikum subkutan an der geplanten Schnittstelle zu injizieren. Verwenden Sie nach fünf Minuten ein Skalpell, um einen Mittellinienschnitt im Schädel zu machen. Und verwenden Sie feine Zangen, um die Haut sanft zurückzuziehen.
Klemmen Sie die Haut mit Bulldogge SerofinKlammern. Und reinigen Sie die freiliegende Schädeloberfläche von Faszien. Bohren Sie mit einem Zahnbohrer mit einem feinen, runden 0,4 Millimeter Bohrer ein Loch in den Schädel über dem Kleinhirn, bis die Dura sichtbar ist.
Legen Sie die Bodenschraube in das Loch und verwenden Sie einen Präzisionsschraubendreher, um die Schraube zu drehen, bis sie die Oberseite des Kleinhirns erreicht. Messen Sie mit Dem stereotaxic-Rahmen die stereotaxic-Koordinaten für den gewünschten Hirnbereich und verwenden Sie den Bohrsatz mit hoher Geschwindigkeit, um einen etwa ein bis zwei Millimeter großen Bereich des Schädels um den Zielbereich zu verdünnen, bis eine dünne, gut polierte transparente Knochenmembran verbleibt. Verwenden Sie dann eine maßgeschneiderte Hakenspitzennadel, um die Dura zu entfernen und einen Tropfen Kochchen in das resultierende Loch zu geben.
Legen Sie die Sonde für das Einsetzen von Mehrkanal-Siliziumsonden an den stereotaxic-Arm, der an einem Magnethalter befestigt ist, und legen Sie den Arm neben den stereotaxic-Rahmen. Stellen Sie die stereotaxic Arme in einem leichten 20-Grad-Vorder-Poster-Winkel ein, um genügend Platz für die Positionierung der beiden anderen Implantate zu lassen. Und verbinden Sie die Sonde mit der Kopfstufe und der Masseschraube.
Verwenden Sie den mikrongenauen stereotaxic Arm, um die Siliziumsonde langsam in den Hippocampus zu senken und die Aufnahmesoftware zu initiieren, um die elektrischen neuronalen Signale aufzuzeichnen, während die Mehrkanal-Siliziumsonde von der Spitze des Kortex bewegt wird, bis die angestrebte dorsoventrale Position erreicht ist. Zeichnen Sie dann gleichzeitig das lokale Feldpotentialsignal aus den Schichten des Kortex und des Hippocampus während des Eindringens auf dem Computerbildschirm auf und verwenden Sie die Wellenaktivität in der Pyramidenschicht der Hippocampusbildung im aufgezeichneten lokalen Feldpotential als Marker der Zielzone. Zum Befüllen der mikrofluidischen Ionenpumpe die Rohre an den Pumpeneinlass anschließen und die Sonde mit 0,05 Molaren GABA-Lösung befüllen.
Entfernen Sie die Rohre, und schließen Sie den Einlass mit Paraffinfolie umwickeln und stellen Sie sicher, dass die mikrofluidische Ionenpumpe sicher am Halter befestigt ist. Achten Sie bei der Montage des Halters am Mikromanipulatorarm, bevor Sie elektrische Leitungen an die Quellmesseinheit anschließen. Mit dem stereotaxic Arm in einem 20-Grad-medio-lateralen Winkel, senken Sie die Pumpe langsam mit axialen Bewegungen so nah wie möglich an der Sonde, ohne die Pumpe biegen zu lassen, bis die Pumpe die dorsoventrale Koordinatennegativ 1200 Mikrometer von der kortikalen Oberfläche erreicht.
Zur Vorbereitung der Anfallinduktion die Metallnadelnbenbe einer 10-Mikroliter-Spritze entfernen und eine Borosilikat-Mikropipette auf die Spritzenspitze fixieren. Legen Sie die Nabe über die Mikropipettespitze und positionieren Sie die Spritze in einem 20-Grad-Seiten-Medial-Winkel. Verwenden Sie eine automatisierte Mikroinjektionspumpe, um 500 bis 1000 Nanoliter 50 Millimolar voller Aminopyridin in künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit in die Spritze zu laden und die Glasmikropipette auf die dorsoventrale Koordinatenposition zu senken.
Injizieren Sie 250 Nanoliter der Lösung in das Gehirn und initiieren Sie die Aufzeichnung in der Software. Dann, beobachten Sie den Bildschirm und warten Sie, bis die erste interictale Spitze angezeigt wird, bevor Sie einen Volt zwischen der Quelle und dem Ziel für 100 Sekunden auf und eine Sekunde für 30 Zyklen, um die GABA-Lösung zu liefern. Die genaue Lokalisierung der Implantate hilft bei der Erfassung der lokalen Feldpotenziale des Hippocampus, bei der Induktion der kleinen Hippocampus-Anfälle und bei der Abgabe von GABA bei Demenkbeginn.
Darüber hinaus kann die Lokalisation der Implantate nach jedem Experiment durch Post-hoc-Histologie überprüft werden. Hier wird ein Beispiel dafür gezeigt, wann anfallähnliche Ereignisse mit der Lieferung von GABA durch die neuartige neuronale Sonde gestoppt werden konnten, wobei die mikrofluidische Sonde einbezogen wird. Wenn vier Aminopyridin in einen größeren Bereich oder auf die Oberseite des Kortex injiziert wurden, wurden die epileptischen Anfälle verallgemeinert, so dass die gelieferte GABA nicht in der Lage war, das Ausmaß der epileptischen Anfälle zu ändern.
Insbesondere hatte die Abgabe von Natriumionen keine signifikante Wirkung auf die vier Aminopyridin-induzierte Aktivität. Dieses Protokoll kann also für jede stereotaxic-Operation nützlich sein, bei der mehrere zerbrechliche Sonden implantiert werden. Mit Hilfe der mikrofluidischen Ionenpumpe könnten andere Arten in geladenen Molekülen eingeführt werden, um nicht nur Epilepsie, sondern auch andere neurologische Erkrankungen zu behandeln.
Die elektrophoretische Abgabe in gewebeverzahnenden Geweben stellt im Allgemeinen einen neuen Ansatz dar, Arten in jedes Weichgewebe zu liefern. Achten Sie bei der Anwendung des 4AP besonders darauf, da es sich um ein Toxin handelt und Epilepsie induziert.
