Dieses Protokoll generiert ein neues Modell für die Temporallappenepilepsie, bei der Mäuse spontane Anfälle entwickelten, und es war sehr nützlich, um die Mechanismen der Epileptogenese zu untersuchen und auch neue Therapien zu untersuchen. Dieses Verfahren bei VGAT-Cre-Mäusen führt zuverlässig zu spontan wiederkehrenden elektrographischen und motorischen und motorischen Kompositanfällen, ohne dass es zu einem ausgedehnten Hippocampus-Zelltod kommt, der häufig nach einem Status epilepticus auftritt, der durch Chemokonvulsiva oder kontinuierliche elektrische Stimulation ausgelöst wird. Um mit der Herstellung von Headsets zu beginnen, schneiden Sie einen 3,5 Zentimeter langen Polytetrafluorethylen-beschichteten Edelstahldraht ab und streifen Sie etwa einen Millimeter der Isolierschicht von beiden Enden des Drahtes ab.
Setzen Sie zwei Stifte auf einen Schraubstockhalter, wobei der untere Teil des Stifts einen längeren Schlitz nach unten hat. Tragen Sie dann Flussmittel auf die abisolierten Enden des Drahtes und die Oberseite der Stifte auf. Verzinnen Sie den abisolierten Teil des Drahtes und die Oberseite der Stifte mit gerade genug Löt, um ihn zu beschichten, ohne auf die Seiten überzulaufen.
Stecken Sie eines der abisolierten Enden des Drahtes so tief wie möglich in den Stift, während das Lot schmilzt. Wiederholen Sie den Vorgang für den zweiten Pin mit dem anderen abisolierten Ende des Kabels. Nachdem Sie die Stifte abgekühlt und 10 Sekunden lang gelötet haben, entfernen Sie die Stifte aus dem Schraubstockhalter und ziehen Sie dann an den Stiften, um sicherzustellen, dass die Verbindung zwischen dem Draht und den Stiften fest ist und hält.
Spülen Sie die Stifte in kaltem Wasser ab und trocknen Sie sie anschließend. Verwenden Sie später ein Ohmmeter, um die Leitfähigkeit zwischen Pin eins und Pin zwei zu überprüfen. Bringen Sie die Stifte am Ende des Drahtes zusammen, um sie parallel und nahe beieinander zu halten.
Klemmen Sie einen Hämostat an die Mitte des Drahtes und drehen Sie den Hämostat, um den Draht fest um sich selbst zu drehen. Nachdem Sie den Hämostat entfernt haben, klemmen Sie die Pinzette zwei Millimeter unterhalb der Stifte auf den verdrillten Draht, um den Draht um 90 Grad zu biegen. Schieben Sie den Draht um 90 Grad zurück über die Pinzette und erzeugen Sie eine weitere Biegung um einen Millimeter von der ersten.
Verwenden Sie eine kleine, scharfe Schere, um den verdrillten Draht in einem Winkel von 45 Grad und 3,5 Millimetern unter der Biegung zu schneiden. Bereiten Sie für jedes Headset zwei bipolare oder doppelpolige verdrillte Elektroden vor. Um eine Referenzelektrode herzustellen, schneiden Sie einen Draht mit einem an beiden Enden gelöteten Stift in zwei Teile.
Schneiden Sie dann den Draht bei sieben Millimetern ab und biegen Sie das Ende des Drahtes einen Millimeter unterhalb der Spitze. Decken Sie die gebogene Ein-Millimeter-Spitze des Drahtes mit einer Pinzette ab und drehen Sie den Draht fest um die Pinzette, um eine kleine Schlaufe mit einem Durchmesser von einem Millimeter zu erzeugen. Biegen Sie dann die Schlaufe senkrecht zum geraden Teil des Drahtes, damit die Drahtspitze wieder nach außen zeigt.
Montieren Sie alle Elektroden nebeneinander in den sechspoligen Sockel mit einem Abstand von sechs Millimetern zwischen den beiden bipolaren Elektroden. Platzieren Sie die Referenzelektrode in der mittleren äußeren Bohrung. Bevor Sie mit der Operation fortfahren, notieren Sie das Gewicht der acht Wochen alten VGAT-Cre-Mäuse.
Legen Sie das Tier dann in eine Induktionskammer, um eine Anästhesie einzuleiten. Legen Sie die betäubte Maus bei 37 Grad Celsius auf ein Heizkissen. Wenn Sie ein rückkopplungsgesteuertes Temperatursystem verwenden, führen Sie die Temperatursonde zur Temperaturüberwachung während der Operation in das Rektum des Tieres ein.
Um die Operation zu beginnen, leiten Sie den Inhalationsanästhesiefluss zum Nasenkegel um und montieren Sie das Tier im stereotaktischen Rahmen, indem Sie die vorderen oberen Zähne vorsichtig in den Schneidezahn legen und den Kegel auf die Nase bewegen. Setzen Sie dann die Ohrbügel in die Ohren ein und befestigen Sie sie am stereotaktischen Rahmen. Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Tieres waagerecht und zentriert ist und bei leichter Sondierung nicht bewegt werden kann.
Sobald das Tier montiert ist, injizieren Sie den Mäusen 0,5 Milliliter Normosol zur Flüssigkeitszufuhr und tragen Sie Augengleitmittel auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie eine Pfote der Hinterbeine kneifen. Wenn der Rückzugsreflex beim Tier fehlt, entfernen Sie die Kopfhaare der Maus um den Operationsbereich herum.
Wenn Sie fertig sind, desinfizieren Sie den sauberen Hautbereich dreimal mit einer abwechselnden Anwendung von Ethanol und Jod, schließen Sie mit Jod ab und injizieren Sie 0,05 Milliliter 0,25% Bupivacain subkutan. Machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt in den Schädel und schneiden Sie dann mit einer chirurgischen Schere einen Teil der Haut heraus, wodurch der Schädel freigelegt wird. Schieben Sie die Haut beiseite, bevor Sie den Schädel mit einem Wattestäbchen von allen darunter liegenden Geweben reinigen.
Reinigen Sie den Schädel mit Wasserstoffperoxid mit sterilen Wattestäbchen und machen Sie die Schädelnähte, Bregma und Lambda sichtbar. Bewegen Sie mit dem stereotaktisch montierten Bohrer die Bohrspitze in null X-, Y- und Z-Koordinaten auf Bregma. Heben Sie dann den Bohrer an und bewegen Sie ihn auf Lambda, um seine Koordinaten zu bestimmen und festzustellen, ob der Kopf waagerecht ist.
Nachdem Sie den Schädel gründlich getrocknet haben, tragen Sie mit dem Applikator einen Tropfen selbstätzenden Zahnkleber auf. Warten Sie 60 Sekunden, bevor Sie den Zahnkleber 40 Sekunden lang mit einem zahnärztlichen UV-Licht aushärten. Eine glänzende Oberfläche zeigt an, dass der Klebstoff effektiv mit dem Schädel vernetzt wurde.
Bohren Sie mit Hilfe eines 0,031-Zoll-Bohrers vorsichtig zwei Gratlöcher beidseitig mit 5.000 Umdrehungen pro Minute (U / min) in den Schädel, um ein Bohren in das Gehirn zu vermeiden. Tragen Sie einen Tropfen Kochsalzlösung auf, um das Bohren der Gratlöcher zu verbessern. Für die Implantation von Elektroden mit Hippocampustiefe bohren Sie drei Millimeter hinterher und drei Millimeter seitlich von Bregma.
Bohren Sie ein Bohrloch für die Referenzelektrode über dem Kleinhirn hinter dem Lambda sechs Millimeter hinter und null Millimeter seitlich von Bregma. Als nächstes montieren Sie den sechspoligen Sockel mit montierten Elektroden in den Elektrodenhalter auf dem stereotaktischen Rahmen. Indem Sie die Elektroden über den entsprechenden Gratlöchern ausrichten, senken Sie das Headset langsam ab und navigieren Sie es, um die beiden bipolaren Elektrodenspitzen direkt über den linken und rechten Hippocampus-Gratlöchern zu lokalisieren, und stellen Sie die Referenzelektrode bei Bedarf so ein, dass sie über dem Loch über dem Kleinhirn schwebt.
Wenn sich die Hippocampus-Drehelektroden direkt über den Löchern befinden, stellen Sie die Z-Achse auf Null und senken Sie die Elektrode langsam auf minus drei Millimeter in den rechten und linken Hippocampus ab und führen Sie die Referenzelektrode in das Loch über dem Kleinhirn. Bereiten Sie den Zahnzement vor, indem Sie das Pulver und die Flüssigkeit in einer Rührschüssel mischen. Decken Sie dann die Schädeloberfläche, die Elektroden und den Raum zwischen der Schädeloberfläche und der Unterseite des Sockels mit Zahnzement ab.
Sobald der Zement getrocknet und ausgehärtet ist, lösen Sie den Elektrodenhalter vom stereotaktischen Arm, heben Sie den Arm an und entfernen Sie den Halter vom Sockel. Nachdem Sie der Maus Ketoprofen und Normosol subkutan verabreicht haben, entfernen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen, um das Tier auf das beheizte Pad im Vivariumkäfig zu bewegen. Sobald Sie vollständig wach sind, bringen Sie das einzelne Tier in den Vivariumkäfig zurück, füttern Sie das Tier mit weichem Futter und überwachen Sie den Gewichtsverlust täglich bis zu 72 Stunden nach der Operation.
Im repräsentativen Geigendiagramm wird die Anzahl der Stimulationen gezeigt, die Mäuse für das Kriterium des entzündeten Zustands benötigen. Die Mäuse erreichten typischerweise den entzündeten Zustand oder erlitten nach 15 Stimulationen fünf bilaterale tonisch-klonische motorische Anfälle. Die Latenz zu spontan wiederkehrenden Anfällen (SRS) betrug 10,7, und die durchschnittliche Häufigkeit der Anfälle betrug 1,3 Anfälle pro Tag.
Die zuverlässige SRS-Verteilung zeigte, dass die Mäuse etwa 23 Tage lang epileptisch waren. In den repräsentativen Bildern ist die Anzahl der Anti-NeuN-positiven Neuronen oder neuronalen Todesfälle in verschiedenen Teilbereichen des Hippocampus und des entorhinalen Kortex zu sehen. Es ist wichtig, dass die beiden bipolaren Elektroden reibungslos in die beiden Gratlöcher eindringen, daher müssen sie sich direkt über den Gratlöchern befinden.
Außerdem ist es wichtig, den Zahnzement sorgfältig aufzutragen und vollständig aushärten zu lassen, bevor der Elektrodenhalter entfernt wird. Diese Technik ermöglicht es uns, epileptische Mäuse zu erzeugen und sie gleichzeitig kontinuierlich mit EEG-Aufzeichnung und Videoaufzeichnung zu überwachen. Und mit den Experimenten, die wir durchführen, können wir dann neuartige Behandlungsstrategien wie Gentherapie testen, um die Häufigkeit, Dauer und Schwere der Anfälle zu reduzieren.
