Diese Studie wurde von der Lundbeck-Stiftung, der NOVO-Nordisk Foundation, dem Dänischen Rat für unabhängige Forschung | Medical Sciences und die NORDEA Foundation Grant an das Center for Healthy Aging.

Alle Verfahren, an denen Tiere beteiligt waren, wurden von der dänischen Nationalen Ethikkommission gemäß den Leitlinien des Übereinkommens des Europäischen Rates zum Schutz von Wirbeltieren, die für experimentelle und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, genehmigt. den ARRIVE-Richtlinien entsprachen. Dies ist ein terminales Verfahren, bei dem die Mäuse vor der Anästhesie-Wiederherstellung eingeschläfert werden.
1. Prächirurgische Präparation
<ol><li>Reinigen Sie den OP-Tisch und die umgebung mit 70% Ethanol. Reinigen und trocknen Sie die chirurgischen Werkzeuge vor der Operation gründlich.</li>
	<li>Anästhetisieren Sie eine NG2DsRed Maus (Tg(Cspg4-DsRed.T1)1Akik/J; beide Geschlechter; 4-8 Monate alt) durch eine peritoneale Injektion von Ketamin + Xylazin (60 mg/kg + 10 mg/kg) gelöst in sterilisiertem Wasser, pH 7,4. Verabreichen Sie zusätzliche Dosen von Ketamin (30 mg/kg) alle 25 min bis zum Abschluss des chirurgischen Eingriffs. Überprüfen Sie regelmäßig Die Reflexe des Schwanzes und der Zehenkneifen, um die Tiefe der Anästhesie zu überprüfen.</li>
	<li>Injizieren Sie Saline subkutan an vier verschiedenen Stellen auf der Rückseite der Maus für ein Gesamtvolumen von 1 ml, um Austrocknung während des Experiments zu verhindern. Um die Augen vor dem Austrocknen zu schützen, tragen Sie Augenschmiermittel auf. Halten Sie die Körpertemperatur bei 37 °C mit einer rektalen Temperatursonde und einer Heizdecke.</li>
</ol>2. Chirurgischer Eingriff
<ol><li>Tracheotomie
	<ol>
<li>Legen Sie die Maus auf den Rücken. 0,04 ml 0,5% Lidocain subkutan unter dem geplanten Schnitt injizieren und 2 min. 2 min. Einen 10 mm langen Schnitt über dem Brustknochen (Manubrium) machen. Trennen Sie die submandibulären Drüsen und SternothyreoseMuskeln, und dann die Luftröhre aussetzen.</li>
		<li>Machen Sie Tracheostomie zwischen zwei Trachealringen mit Schere. Legen Sie ein kleines Metallrohr mit einer Länge von 16,2 mm und einem Durchmesser von 1 mm in die Luftröhre ein. Schließen Sie das Rohr an ein mechanisches Beatmungsgerät und einen Capnographan an, um das endexpiratorische CO2 zu überwachen (Abbildung 1A).</li>
	</ol></li>
	<li>Kathetereinfügung
	<ol>
<li>0,5% Lidocain (0,04 ml) subkutan unter dem geplanten Schnitt injizieren und 2 min warten.</li>
		<li>Mit feinen Spitzenzangen trennen Sie die Arterie sanft von der Vene. Stoppen Sie den Blutfluss stromaufwärts mit einer mikrovaskulären Klemme. Verengen Sie den Blutfluss flussabwärts mit einer 10-0 Nylon-Nähte, die beide Blutgefäße ligan.</li>
		<li>Verwenden Sie mikrosezierende Scheren, um einen kleinen Schnitt sowohl in der Arterie als auch in der Vene zu machen. Setzen Sie Kunststoffkatheter in beide Blutgefäße ein. Sichern Sie die Katheter durch Anziehen der Nähte (8-0 oder 10-0 Nylonnähte abhängig von der Gefäßgröße) ohne Kompromisse bei Katheterlumen. Entfernen Sie die mikrovaskuläre Klemme und schließen Sie die Haut.</li>
		<li>Überwachen Sie den Blutdruck über den arteriellen Katheter. Messen Sie die Werte der Blutgase in arteriellen Blutproben (50 l) vor und nach jedem Experiment (Normalwerte: pO2, 90-120 mmHg; pCO2, 35-40 mmHg; pH, 7,25-7,45) mit einem Blutgasanalysator. Verwenden Sie den Venenkatheter zur Infusion von Fluorescein und Anästhesie.</li>
	</ol></li>
	<li>Kraniotomie
	<ol>
<li>Rasieren Sie das Fell vom Kopf der Maus zwischen den Ohren. 0,04 ml 0,5% Lidocain subkutan unter dem geplanten Schnitt injizieren und 2 min warten.</li>
		<li>Wischen Sie den Schädel mit einer 10% Eisen-Chlorid-Lösung, um das Periost zu entfernen. Spülen Sie den Schädel gründlich mit Derinline. Kleben Sie eine Metallkopfstange mit Cyanoacrylatkleber und Aktivator an den Schädel (Abbildung 1A). HINWEIS: Die Metallkopfstange ist 75 mm lang und 13,5 mm breit, mit einem runden Loch von 5 mm Durchmesser in der Mitte.</li>
		<li>Bohren Sie eine Kraniotomie mit 4 mm Durchmesser, zentriert bei 0,5 mm hinter und 3 mm rechts neben dem Bregma über den rechten Sinnesfass-Kortex. Entfernen Sie die Dura mit einem Feinspitzen-Gefäßdilatator.</li>
		<li>Bedecken Sie den exponierten Kortex mit 0,75% Agarosegel, gelöst in künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF; pH = 7,4) und auf 35 °C abgekühlt. Abdeckung 80-90% der Kraniotomie mit einem Glasdeckel in einem Winkel von 10-15° zur Metallkopfstange (Abbildung1B), die das Einsetzen und Platzieren der Glas-Mikropipette ermöglicht.</li>
		<li>Um die Pulsation des Gehirns zu minimieren, kleben Sie die beiden Ecken der Glasabdeckung mit Cyanoacrylatkleber und Aktivator auf die Metallkopfstange. Tragen Sie den Aktivator sorgfältig auf, um zu verhindern, dass er auf das exponierte Gehirn kommt. Spülen Sie den geklebten Glasdeckel anschließend gründlich mit Derinline.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie das Einführen der Whisker Pad Stimulationsonde durch. Legen Sie einen Satz von maßgeschneiderten bipolaren Elektroden (8 mm Länge und 0,25 mm Dicke) perkutan in die linke Seite des Gesichts, um die Ramus-Infraorbitalis des trigeminalen Nervs kontralateral zur Kraniotomie zu stimulieren. Positionieren Sie die Kathode in der Nähe der Pause infraorbitalis, und legen Sie die Anode in die Kaumuskeln7. Führen Sie die Stimulation mit einem elektrischen Stimulator mit einer Intensität von 1,5 mA für 1 ms in Zügen von 20 s bei 2 Hz durch.</li>
	<li>Nach Abschluss der Operation einen Bolus von 0,05 ml Fluorescein Isothiocyanat-Dextran (FITC-Dextran, 4% w/v, Molekulargewicht [MW] 50.000) in die femorale Vene geben, um das Blutplasma zu kennzeichnen. Ketamin absetzen und die Anästhesie auf eine kontinuierliche intravenöse Infusion von Chloralose (17% w/v, Endkonzentration) gemischt mit FITC-Dextran (2% w/v, Endkonzentration) bei 0,02 ml/10 g/h umstellen. Warten Sie etwa eine halbe Stunde auf die Stabilisierung des neuen Anästhesiezustand. HINWEIS: Sowohl FITC-Dextran als auch S-Chloralose werden in 0,9% Salzsäure gelöst.</li>
</ol>3. Erste Zwei-Photonen-Bildgebungssitzung
<ol><li>Übertragen Sie die Maus auf die Bühne eines kommerziellen Zwei-Photonen-Mikroskops (Tabelle der Materialien). Unter sowohl rotem fluoreszierendem Protein (RFP, Abbildung 1C) als auch grünen fluoreszierenden Proteinen (GFP, Abbildung 1C)modisch der Epifluoreszenzbeleuchtung, machen Sie ein Bild des exponierten Kortex mit einem 5-fachen Objektiv. Verwenden Sie das RFP-Bild als "Karte" zum Einfügen der Glas-Mikropipette in der nächsten Sitzung. HINWEIS: Die GFP-Karte wird verwendet, um Venen/Venen von Arterien/Arteriolen zu unterscheiden.</li>
	<li>Führen Sie zwei Photonenaufnahmen mit dem Zwei-Photonen-Mikroskop und einem 25x 1,0 numerischen Blende (NA) Wasser-Immersion-Objektiv mit Piezomotor durch. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 900 nm ein. Durchsuchen Sie den Kortex und folgen Sie jeder durchdringenden Artebole und finden Sie ihre horizontalen Zweige (1. Ordnung Kapillaren).</li>
	<li>Bild durchdringende Arterioles und ihre 1. Ordnung Kapillaren in Ruhe und während Derwhisker Pad Stimulation. Siehe die detaillierten Abbildungsparameter in Abschnitt 5.</li>
	<li>Markieren Sie Positionen von Kapillaren 1. Ordnung mit >5% Vasodilatation während der Whisker-Pad-Stimulation auf der RFP -Karte (Abbildung 1C). Standorte mit <5% Vasodilatation werden als außerhalb der Whisker-Fass-Kortex-Region betrachtet. HINWEIS: Wenn im Experiment Wildtypmäuse anstelle von NG2DsRed-Mäusen verwendet werden, wird das GFP-Bild stattdessen als "Karte" verwendet.</li>
</ol>4. Einsetzen der Glas-Mikropipette
<ol><li>Bereiten Sie Glas-Mikropipetten zum Puffen mit einem Pipettenzieher(Materialtabelle). Die Glas-Mikropipetten haben einen Widerstand von 3-3,5 M' und eine Verjüngungslänge von 4,5-5 mm. Laden Sie eine Pipette mit einer Mischung aus 1 mM ATP und 10 m Alexa 594, um die Pipettenspitze unter der Epi-Leuchtstofflampe und dem Zwei-Photon-Mikroskop zu visualisieren.</li>
	<li>Montieren Sie die Glas-Mikropipette auf einen Patch-Klemmenhalter und schließen Sie sie an eine Luftpumpe an. Stellen Sie den Haltedruck der Pumpe auf 0 psi ein.</li>
	<li>Mit roter Epifluoreszenzbeleuchtung konzentrieren Sie sich mit dem 5x Objektiv auf die Pipettenspitze. Legen Sie die Glas-Mikropipette in das aCSF über der Agarose. Stellen Sie den Haltedruck der Luftpumpe auf 0,2 psi ein. Eine kleine rote Wolke kann beobachtet werden, die aus der Pipettenspitze im aCSF ausgeworfen wird. Dadurch soll eine Verstopfung beim Einsetzen der Pipetten verhindert werden.</li>
	<li>Wählen Sie eine der markierten Positionen in der RFP-Karte als Ziel aus. Bewegen Sie die Pipettenspitze mit einem Abstand von 30 m auf die horizontale Ebene der Abdeckungsglaskante, die in etwa auf das Ziel in der x-y-Ebene zeigt.</li>
	<li>Senken Sie die Pipettenspitze vorsichtig in z-Achse unter dem Deckelglasschlupf. Dann beginnen Sie, die Glaspipette in Richtung des Ziels bis zu 500 m über der Hirnoberfläche vorzutreiben. Wechseln Sie häufig den Fokus zwischen der AbdeckungGlaskante, der Pipettenspitze und der Gehirnoberfläche, um sicherzustellen, dass genügend freier Platz für die Verlegung der Pipette vorhanden ist.</li>
	<li>Schalten Sie das Ziel auf 25x. Zentrieren Sie die Pipettenspitze neu und bringen Sie die Pipettenspitze weiter in Richtung Ziel auf der RFP -Karte vor. Bewahren Sie die Pipettenspitze in der Agaroseschicht auf.</li>
	<li>Wenn sich die Pipettenspitze über der Hirnoberfläche befindet, schalten Sie den Bildgebungsmodus auf zwei Photonenmikroskopie um. Konzentrieren Sie sich auf eine Zielposition, an der Puff. Notieren Sie sich die x-, y-Koordinaten (x0, y0) und ihre Tiefe unter der Oberfläche (z0). Berechnen Sie die Koordinaten der Einfügemarke auf der Hirnoberfläche (xi, yi) wie folgt: xi = x0 + z0 / tan yi = y0 wobei der Winkel zwischen dem Pipettehalter und der horizontalen Ebene ist.</li>
	<li>Positionieren Sie die Pipettenspitze zu den Koordinaten (xi, yi) auf der Gehirnoberfläche. Legen Sie die Pipette vorsichtig und langsam ein, bis sie erreicht ist (x0, y0, z0). Wenn sich ein Gefäß einem Einfügepfad im Weg befindet, ziehen Sie die Pipette zurück, und berechnen Sie andere Einfügekoordinaten und den Pfad neu. oder drehen Sie die Bühnenplatte leicht (wie in Abbildung 1Aangegeben).</li>
	<li>Stellen Sie den Haltedruck der Pumpe auf 0 psi und den Auswurfdruck auf 10-15 psi ein. Puff ATP für 200-400 ms am Zielort während der Zwei-Photon-Bildgebung. Passen Sie den Druck und die Dauer des Puffens für jede Pipette und im Laufe der Zeit an, wie im Diskussionsteil erläutert.</li>
</ol>5. Hyperstack Zwei-Photon-Bildgebung
<ol><li>Führen Sie Experimente mit dem Zwei-Photonen-Mikroskop und einem 25 x 1,0 NA-Wasser-Immersion-Objektiv mit Piezomotor durch. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 900 nm ein. Filtern Sie das emittierte Licht, um rotes Licht von DsRed (Pericyten)/Tetramethylrhodamine Isothiocyanat-Dextran (TRITC-dextran) zu sammeln, das Blutplasma und grünes Licht aus FITC-Dextran (Blutplasma)/GCaMP6 (GFP, astrozytisches Kalzium) färbt.</li>
	<li>Produziere einen hochauflösenden Z-Stack an der Ortung von Interesse, der eine durchdringende Arteriole, eine 1. Kapillare 1. Ordnung, eine 2 nd-Kapillare und möglicherweise benachbarte Fluoreszenzzellen (z. B. Pericyte, Astrozyten) enthält. Bestimmen Sie das x*y*z Volumen der Hyperstack-Bildgebung, indem Sie die 3D-Struktur der Blutgefäße so weit wie möglich einbeziehen. Die Gesamthöhe jedes Stapels kann zwischen 30 und 50 m variieren, während die x-y-Ebene ungefähr eine Fläche von 60 x 40 m abdeckt.</li>
	<li>Stellen Sie den Bildstapel in der Bildverarbeitungssoftware ein, der aus 8-10 Ebenen mit einem Abstand zwischen den Ebenen von 4-5 m besteht. Das Piezo-Motor-Objektiv stoppt auf jeder Ebene auf der Z-Achse, um das Bild jeder Ebene zu erfassen. Die Abtastrate beträgt 1 s pro Stapel und die Pixelauflösung in der x-y-Ebene beträgt 0,2-0,3 m (Abbildung 2A). Eine Aufnahme enthält normalerweise 10 Pre-Puff-Bildstapel und 150 Post-Puff-Bildstapel.</li>
</ol>6. Datenverarbeitung
<ol><li>Verarbeiten Sie Daten mit maßgeschneiderter Analysesoftware. Flatten Sie jeden Bildstapel durch maximale Intensitätsprojektion in ein Bild (Abbildung2B). Zeichnen Sie einen rechteckigen Bereich von Interesse (ROI) mit einer Breite von 3 m senkrecht über das Gefäß von Interesse (Abbildung 2C).</li>
	<li>Um Interferenzen durch Schatten roter Blutkörperchen und durch kleinere Schwingungen des Kortex zu minimieren, durchschnittlich den rechteckigen ROI, indem Sie ihn in eine Linie projizieren, die dann das durchschnittliche Profil des Gefäßsegments darstellt. Tun Sie dies für jedes Bild mit maximaler Intensität.</li>
	<li>Zeichnen Sie die Profillinien als 2D-Bild mit der x-Achse, die Bilder mit maximaler Intensität in chronologischer Reihenfolge darstellt (Abbildung2D, Oberteil). Verwenden Sie einen aktiven Konturalgorithmus (Chan-Vese-Segmentierung), um die Kanten des Gefäßes8,9 (angezeigt durch rote Kurven; Abbildung 2 D, obere Platte).</li>
	<li>Berechnen Sie den Zeitverlauf des Durchmessers ändert sich als die Differenz zwischen den Rändern des Blutgefäßes (vertikaler Abstand zwischen der oberen und unteren roten Kurve in Abbildung 2D, untere Platte). Normalisieren Sie Durchmesseränderungen in Vorpuffungsdurchmesser Und Diagrammkurven des Durchmessers ändern sich im Laufe der Zeit. Tun Sie dies für jeden ROI (Abbildung 2E).</li>
	<li>Die Gefäßantwortamplitude ist definiert als die höchste/niedrigste Peak-Amplitude nach dem Puffen. Die Antwortlatenz ist definiert als die Latenz der halbmaximalen Amplitude (Abbildung 2G). Verfolgen Sie manuell die skelettierte Gefäßstruktur, indem Sie Knoten entlang der Gefäße platzieren (Abbildung 2F) und die geografische Entfernung zwischen jedem ROI und dem eindringenden Arteriol messen. Berechnen Sie die CVR-Geschwindigkeit, indem Sie die Entfernungen durch Latenzunterschiede dividieren.</li>
</ol>7. Virale Vektorinjektion
<ol><li>Um gleichzeitig astrozytische Kalziumreaktionen zu untersuchen, injizieren Sie ein Volumen von 0,6 l viralen Vektor (pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f, Addgene) in den somatosensorischen Kortex von NG2DsRed Mäusen, nach dem standard stereotaktischen viralen Vektorinjektionsverfahren 10.</li>
	<li>Nach drei Wochen drücken Astrozyten in maussomatosensorischem Kortex den genetisch kodierten Kalziumindikator GCaMP6f aus. Folgen Sie dem oben genannten chirurgischen Verfahren und der Zwei-Photon-Bildgebung für Mäuse. Um zwischen Astrozyten und Gefäßlumina zu unterscheiden, wird TRITC-dextran anstelle von FITC-dextran verwendet, um Gefäßluminarot zu färben.</li>
</ol>

<ol>
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H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+Gene+Delivery+in+the+Rodent+Brain.">Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Role+for+the+Vascular+Endothelium+in+Functional+Neurovascular+Coupling+in+the+Brain.">A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).</li><li>Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. 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B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swept+Confocally-Aligned+Planar+Excitation+(Scape)+Microscopy+for+High+Speed+Volumetric+Imaging+of+Behaving+Organisms.">Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Eine Herausforderung für Gefäßstudien ist die präzise Messung der Gefäßdurchmesser. Die Methode, die wir hier beschreiben, verwendete ein motorisiertes Piezoobjektiv, um eine schnelle und sich wiederholende Hyperstack-Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie zu machen. Erstens ermöglicht diese Methode wiederholte Untersuchungen der durchdringenden Arteriole,1. Ordnung und 2. Ordnung Kapillaren ohne Fokusverlust und führte zur Entdeckung von langsam durchgeführten Gefäßreaktionen in Kapillaren in...

Das Gehirn hat eine hohe Energieverbrauchsrate. Etwa 20% des Sauerstoffs und 25% der Glukose, die vom menschlichen Körper verbraucht wird, sind der Gehirnfunktion gewidmet, während das Gehirn nur 2% der gesamten Körpermasse einnimmt. Die Aufrechterhaltung der normalen Gehirnfunktion erfordert eine ausreichende und effiziente Versorgung mit Sauerstoff und Ernährung durch Dendurchfluss in einem komplexen Netzwerk von Gefäßen. Lokale Gehirnaktivität und zerebraler Blutfluss (CBF) sind robust gekoppelt, abhängig von den funktionellen Eigenschaften von Neuronen, Astrozyten, Pericyten, glatten Muskelzellen (SMCs) und Endothelzellen (ECs)1. Kürzlich haben sich die ersten Aufträge von Kapillaren, die von durchdringenden Arteriolen verzweigen, als "Hotspot" 2 herauskristallisiert,dereine aktive Regulierung des Kapillarblutflusses zeigt. An diesem "Hotspot" im somatosensorischen Kortex der Maus wurde sowohl bei der Whiskerstimulation als auch bei der lokalen Auswurfung (Puffing) von ATP mit einer Glasmikropipette3eine langsam durchgeführte Gefäßreaktion (CVR) entdeckt.
Obwohl die In-vivo-Bildgebung mittels zwei photonenlaserscanning-Fluoreszenzmikroskopie weit verbreitet ist, um neurovaskuläre Reaktionen in der Großhirnrinde zu untersuchen, wurden in den meisten Studien Blutgefäßdurchmesser gemessen und ihre zweidimensionale (2D) x-y-Ebene. Die Herausforderungen sind: Erstens bauen zerebrale Blutgefäße und ihre umarmenden Astrozyten, Pericyten und SMCs Zweige in drei Dimensionen (3D). Es ist daher wichtig, ihre Wechselwirkungen in 3D zu untersuchen. Zweitens wird schon eine geringe Menge an Drift im Fokus die genaue Messung sowohl der Gefäßdurchmesser als auch der zellulären Fluoreszenzsignale beeinflussen. Schließlich sind CVRs schnell und weitreichend in drei Dimensionen. Das 3D-Volumenscannen ist optimal für die Erkennung von CVRs und die Enthüllung ihrer Mechanismen. Wir implementierten ein Piezo-Motorobjektiv in einem Zwei-Photonen-Mikroskop, um den somatosensorischen Kortex der Maus in vivo zu untersuchen, wodurch präzise Durchmessermessungen durch maximale Intensitätsprojektionen der erhaltenen Bilder ermöglicht wurden.
Glas-Mikropipetten wurden häufig für in vivo Gehirnstudien verwendet, z.B. zum Massenladen organischer Farbstoffe4, Aufzeichnung EEGs5 und zum Patch-Spannen6. Dennoch bleiben Einschränkungen bestehen. Üblicherweise wird die Spitze der Glas-Mikropipette ungenau platziert, oder die Mikropipette wird nicht für lokale Eingriffe verwendet. Hier haben wir das Verfahren des Einsetzens von Mikropipetten und des lokalen Auswurfs optimiert.
Darüber hinaus bietet die Kombination aus 3D-Zweiphotonenmikroskopie und genetisch kodierten Fluoreszenzindikatoren eine beispiellose Möglichkeit, neurovaskuläre Kopplung in einem 3D-Bereich zu untersuchen. In dieser Studie nutzten wir dies und injizierten virale Vektoren, die astrozytenspezifische genetisch kodierte Kalziumindikatoren in den somatosensorischen Kortex der Maus trugen. Astrozyten sowie Gefäßdurchmesser wurden gleichzeitig durch die Kombination verschiedener fluoreszierender Marker abgebildet.
Insgesamt präsentieren wir eine optimierte Methode des lokalen Auswurfs (Puffens) durch Glas-Mikropipette und schnelle Zwei-Photonen-Hyperstack-Bildgebung, die eine präzise Messung von Kapillardurchmesseränderungen ermöglicht. Darüber hinaus bietet unsere Methode ein neuartiges Werkzeug, um gleichzeitig 3D-Profile von Ca 2+-Antworten in Astrozyten und Gefäßdurchmesserreaktionen zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1161px;" width="1162">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose</td>
			<td style="width:263px;">Sigma&#8211;Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">A6138</td>
			<td style="width:524px;">Apply upon exposed cortex for protection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 594</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>Stain puffing compound to red fluorescent color</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyanoacrylate glue and activator</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>Adhesives and SF7452</td>
			<td>Glue for metal piece and coverglass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eye lubricant</td>
			<td style="width:263px;">Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Keep the mouse eyes moisterized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">FD500S</td>
			<td>Blood serum dye, green fluorescent color</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NG2DsRed mice</td>
			<td style="width:263px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:152px;">8241</td>
			<td style="width:524px;">These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f</td>
			<td style="width:263px;">Addgene</td>
			<td style="width:152px;">52924-AAV5</td>
			<td>Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRITC-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">52194</td>
			<td>Blood serum dye, red fluorescent color</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">List of Equipments</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Air pump</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PV830</td>
			<td>Give air pressure to pipette puffing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Blood gas analyzer</td>
			<td style="width:263px;">Radiometer</td>
			<td>ABL 700</td>
			<td>Measure levels of blood gases&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Blood pressure monitor</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>BP-1</td>
			<td>Monitor aterial blood pressure</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Body temperature controller</td>
			<td>CWE</td>
			<td>Model TC-1000</td>
			<td>Keep the mouse body temperature in physiological range</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:223px;">Capnograph</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>Type 340</td>
			<td>Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Electrical stimulator</td>
			<td style="width:263px;">A.M.P.I.</td>
			<td>ISO-flex</td>
			<td>Apply whisker pad stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Mechanical ventilator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>D-79232</td>
			<td>Mechanically ventilate the mouse in physiological range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:263px;">Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Two-photon microscope</td>
			<td>Femtonics Ltd</td>
			<td>Femto3D-RC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">List of Surgical Instruments</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anatomical tweezer&#160;</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>09-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Angled and balanced tweezer</td>
			<td>S&#38;T AG</td>
			<td>00595 FRAS-18 RM-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iris scissor</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>05-1450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro vascular clamp</td>
			<td>S&#38;T AG</td>
			<td>462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse vascular catheters</td>
			<td>Verutech</td>
			<td>100828</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo three-dimensional two-photon microscopy to study conducted vascular responses by local atp ejection using a glass micro-pipette

Die Aufrechterhaltung der normalen Gehirnfunktion erfordert eine ausreichende und effiziente Versorgung mit Sauerstoff und Ernährung durch ein komplexes Netzwerk von Gefäßen. Die Regulierung des zerebralen Blutflusses (CBF) ist jedoch unvollständig verstanden, insbesondere auf Kapillarebene. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das häufig zur Untersuchung von CBF und seiner Regulierung eingesetzt wird. Derzeit ist dieses Feld durch den Mangel an in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie-Studien begrenzt, die (1) CBF-Antworten in drei Dimensionen untersuchen, (2) vaskuläre Reaktionen und (3) lokalisierte Interventionen innerhalb des Gefäßnetzwerks durchführen. Hier beschreiben wir eine 3D-in-vivo-Methode, die die Zwei-Photonen-Mikroskopie verwendet, um durchgeführte Gefäßreaktionen zu untersuchen, die durch den lokalen Auswurf von ATP mit einer Glasmikropipette ausgelöst wurden. Unsere Methode verwendet schnelle und sich wiederholende Hyperstack-Zwei-Photon-Bildgebung, die präzise Durchmessermessungen durch maximale Intensitätsprojektion der erhaltenen Bilder ermöglicht. Darüber hinaus zeigen wir, dass diese Methode auch verwendet werden kann, um 3D-astrozytische Kalzium-Antworten zu untersuchen. Wir besprechen auch die Vorteile und Grenzen des Einsetzens von Mikropipetten aus Glas und der Zwei-Photonen-Hyperstack-Bildgebung.

Nach Abschluss der Operation wurden die Mäuse zum Zwei-Photonen-Mikroskop transportiert (Abbildung 1A). Eine Glas-Mikropipette mit 1 mM ATP wurde in der Nähe des Zielblutgefäßes am Zielort eingesetzt (Abbildung 1B).
Wir führten Hyperstack-Bildgebung durch, während wir einen Puff von 1 mM ATP gaben (Abbildung 2A, Ergänzendes Video 1...

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In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

Wir präsentieren ein optimiertes lokales Auswurfverfahren mit einer Glas-Mikropipette und einem schnellen Zwei-Photon-Hyperstack-Bildgebungsverfahren, das eine präzise Messung von Änderungen des Kapillardurchmessers und die Untersuchung seiner Regulierung in drei Dimensionen ermöglicht.

In Vivo dreidimensionale zwei-photonische Mikroskopie zur Untersuchung von durchgeführten Gefäßreaktionen durch lokale ATP-Auswurf mit einer Glas-Mikropipette

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the ...

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die langsam durchgeführten gefäßvaskulären Reaktionen in zerebralen Kapillaren zu untersuchen, die durch den lokalen Auswurf von ATP ausgelöst werden. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, lokale synaptische Aktivitäten durch lokale Pipettenauswurf zu simulieren und das spärliche Gefäß durch 3D-Zweiphotonenmikroskopie im Fokus zu halten. Diese Methode kann auch für die Untersuchung von Hirnneurinom und Glialaktivität im Ruhezustand und bei Stimulation in drei Dimensionen verwendet werden. Demonstrieren das Verfahren wird Michael L

in-vivo-three-dimensional-two-photon-microscopy-to-study-conducted

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.4K Aufrufe.  University of Copenhagen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die langsam durchgeführten gefäßvaskulären Reaktionen in zerebralen Kapillaren zu untersuchen, die durch den lokalen Auswurf von ATP ausgelöst werden. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, lokale synaptische Aktivitäten durch lokale Pipettenauswurf zu simulieren und das spärliche Gefäß durch 3D-Zweiphotonenmikroskopie im Fokus zu halten. Diese Methode kann auch für die Untersuchung von Hirnneurinom und Glialaktivität im Ruhezustand und bei ...

Serie: In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Forschung

Neurowissenschaften

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In-vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie einzelner Nervenenden in der Haut

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Die Quantifizierung der zerebrale vaskuläre Architektur unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie in einem Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Two-photon Imaging of Microglial Processes&#039; Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

Zwei-Photon Imaging der Mikroglia Prozesse Anziehung in Richtung ATP oder Serotonin im akuten Gehirnscheiben

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

Visualisierung der Proteinkinase Eine Aktivität bei kopffixierten Behaving Mäusen mit In Vivo Zweiphotonen fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...