Forschung in der Autoren-Labor wird durch die National Institutes of Health gewährt R37-HL041026, R01-HL086483 und R01-HL056786 (SSS) und F32-HL097463 und T32-AR048523 (PB) von der United States Public Health Service unterstützt.

1. Animal Care und Verwenden Nach Überprüfung und Genehmigung von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschusses sind männliche Mäuse mindestens 12 Wochen alt werden. Eine Maus ist mit Pentobarbital-Natrium (60 mg / kg) durch intraperitoneale (ip) Injektion. Während chirurgischer Eingriffe und experimentelle Protokolle, wird die Narkose durch Nachträge (10-20% der ersten Injektion, ip) bei Bedarf (; gekennzeichnet durch Rückzug als Reaktion auf Zehe oder Schwanz kneifen alle 30-60 Minuten) gehalten. Nach Abschluss der experimentellen Verfahren der Maus ist mit Pentobarbital (ip) und eingeschläfert durch Genickbruch überdosiert. 2. Mikropipetten und Microiontophoresis <ol><li> Microiontophoresis Mikropipetten (intern Spitzendurchmesser, ~ 1 m) sind aus Borosilikatglas Kapillarröhrchen mit einem horizontalen Pipette puller vorbereitet. Unsere haben eine ca. 5 mm Kegel für Steifigkeit, längere verjüngt sind flexibler. </li><li> Mikropipetten mit 1M ACh (Abbildung1A-C) in 18,2 MOhm Wasser gelöst verfüllt. Für Verfüllung ist eine Mikrokapillare Rohr bis 0,2 um-Filter gekoppelt mit einer Spritze mit dem Agonisten des Interesses (Abbildung 1) verbunden. Diese können leicht hergestellt werden (siehe unten) oder gekauft von kommerziellen Anbietern. Die Mikrokapillare Rohr wird in das hintere Ende der Mikropipette und ACh-Lösung ist in das Lumen geliefert, während Zurückziehen der Mikrokapillare Rohr als Mikropipette füllt eingefügt. Halten Sie die Mikropipette mit der Spitze nach unten zeigt, werden Luftblasen durch leichtes Schnippen der Mikropipette entfernt. </li><li> Die Mikropipette ist in einer Halterung in einem Mikromanipulator (Abbildung 2) montiert ist. Der Halter hat einen Silberdraht Anschluss der ACh-Lösung innerhalb der Mikropipette auf einen externen Pin, die wiederum an den Pluspol einer microiontophoresis Programmierer angeschlossen ist. Eine zweite Silberdraht am Rand des Gewebes Vorbereitung gesichert ist an den Minuspol der Schaltung verbunden vollständig wie die Spitze der Mikropipette in die physiologische Kochsalzlösung über die Vorbereitung fortgeschritten. </li><li> A Haltestrom wird angewandt, um eine Vasodilatation zu verhindern (oder fluoreszierenden response), wenn der Mikropipette Spitze positioniert ist neben der arteriellen Wand. Beibehalten Strom wird mit der Größe der Mikropipette Spitze (Innendurchmesser = 1 m) und Agonistkonzentration variieren, liegt aber in hohem Maße reproduzierbar für definierte Parameter (wir verwenden ~ 200 nA für 1M ACh, 1 um tip). Die Beibehaltung Strom mehr deckungsgleich mit der Lieferung eines Rückschlags Strom über den elektronischen Auslöser (Supplementary Abbildung 1) mit dem Beginn der Bildaufnahme synchronisiert. </li></ol> 3. Mikromanipulation <ol><li> Eine benutzerdefinierte Plattform für einen XY Mikroskoptisch wurde aus ferromagnetischen Edelstahl gefertigt. Platform Abmessungen (8.1 &quot;x 12&quot; x 13 &quot;) ermöglichen genügend Raum zu positionieren Mikromanipulatoren rund um die experimentelle Vorbereitung wie gewünscht (Abbildung 2A). Mikromanipulatoren gesichert, um magnetische Basen (Abbildung 2B) ermöglichen die Positionierung als durch die Herstellung diktiert. Diese sind direkt auf den hergestellten Plattform rund um die Vorbereitung für die Positionierung Mikropipetten auf Seiten von Interesse (Abbildung 2C) platziert. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse <ol><li> Mit der Mikropipette Spitze benachbart zu einer Arteriole, gibt es Fluoreszenz-Reaktion auf ACh (Haltestrom als angepasst, um ein Auslaufen zu verhindern ACh). Unterhalb einer Schwelle Reiz gab es keinen Effekt. Doch wie Reizintensität, erhöhte endotheliale Kalzium Fluoreszenz über schrittweise größere Entfernungen entlang der Arteriole, ebenso wie die Intensität der Fluoreszenz am Ort der Stimulation (Abbildung 3). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Verfahren zur Verfüllung Microiontophoresis Pipetten. A) Ein Mikrokapillare Rohr (grüner Pfeil) ist in einer Klemmverschraubung (blauer Pfeil) an einem 0,2 um-Filter (lila Pfeil), die dann mit einer Spritze mit 1 M ACh gefüllt ist angebracht gesichert. B) Die Mikrokapillare Rohr wird in die eingespeist microiontophoresis Pipette durch den Back-End und die Lösung wird verschoben, um das Lumen der Mikropipette. C ausfüllen) Nachdem die Pipette gefüllt ist, halten Sie die Spitze nach unten und sanft Flick über den Kegel zu Blasen (schwarzer Pfeil) entfernen. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Benutzerdefinierte Plattform für Mikromanipulator Placement. .. A) A ferromagnetischen Edelstahl-Plattform wurde auf einem benutzerdefinierten MVX10 Mikroskop Base mit einem XY-translationale Bühne platziert B) Circular magnetische Basen an der Unterseite der kompakten 3-Achsen-Mikromanipulatoren angebracht C) Mikromanipulatoren rund um die experimentelle Vorbereitung positioniert (siehe zugehörige Protokoll: JoVE ID # 2874) zu studieren bestimmte Gebiete von Interesse. Dieir kompakte Größe und Vielseitigkeit ermöglichen mehrere Mikropipetten gleichzeitig verwendet werden. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Calcium-Fluoreszenz in den Arteriolen. Calcium Fluoreszenz von Endothelzellen der Arteriolen Wand nahm mit Reizintensität. Die ersten 3 Platten gezeigten Bilder der Fluoreszenz Reaktionen auf A) 250 nA, B) 500 nA und C) 1000 nA Auswurf Strom (alle 500 ms Pulsdauer). Die Entfernung, über die Endothelzellen Kalzium Fluoreszenz erhöht wird durch Klammern in AC (~ 130, 270 und 400 um jeweils) angegeben. Die Bezugslinie über die Arteriole in jedes Panel zeigt an, wo Fluoreszenz Antworten (F / Fo) zu ACh an der Stelle der Anregung aufgenommen wurden. D) Aufnahmen von F / Fo-Zeit für die Erhöhung ACh Reize. Als Auswurf aktuellen, erhöhte F / Fo in Amplitude und Dauer. Beachten Sie, dass 100 nA Stimulus unterhalb Schwelle war und hatte keine Wirkung. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900sup1.jpg" alt="Ergänzende Abbildung 1" /> Ergänzende Abbildung 1. Schaltplan für die elektronische auslösen. Diese Schaltung ist über eine Schnittstelle mit einer parallelen Schnittstelle von einem PC. Wenn diese Funktion aktiviert es eine Konstante TTL Puls von 5V zur Verfügung stellt. Der 7805 Chip ist ein 5V-Spannungsregler verbunden mit einem 9-12V DC Netzteil (eine Batterie von entsprechenden Spannung ist in Ordnung). Output aus der 7805 versorgt das Quad Bilateral Switch und den Ausgang der Schaltung. Eingang über den 1K Widerstand ist aus dem Computer.

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	<li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability:+an+electron+microscopic+study.">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li><li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree:+a+topographic+study.">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Observation+of+Skeletal+Muscle+Blood+Vessels+(Rat+Cremaster).">Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster).</a> J. Physiol. 172, 123-137 (1964).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li><li>Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+microvascular+pressures+in+normal+and+spontaneously+hypertensive+rats.">Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats.</a> Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).</li><li>Klitzman, B., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+hematocrit+and+red+cell+flow+in+resting+and+contracting+striated+muscle.">Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle.</a> Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).</li><li>Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &amp;amp, S. e. g. a. l., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle.">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li><li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo.">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li><li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles.">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li><li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+importance+of+the+endothelial+K++channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction.">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li><li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li><li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagated+endothelial+Ca2++waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo:+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice.">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+denervation+on+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> J. Anat. 100, 305-316 (1966).</li><li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+among+arteriolar,+regional,+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle.">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation:+Role+of+conducted+vasodilation.">Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiol. , (2011).</li><li>Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cremaster+muscle+hemodynamics+due+to+disruption+of+the+deferential+feed+vessels.">Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels.</a> Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).</li></ol>

Alle Verfahren und Protokolle mit Tieren wurden von der Animal Care und Verwenden Ausschuss der University of Missouri genehmigt und durchgeführt in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Produktion dieses Artikels von Stanford Photonics wurde gesponsert.

Die hier beschriebene Protokoll zeigt Methoden für die Vorbereitung und Durchführung von Mikropipetten für microiontophoresis. Lieferung von Acetylcholin wird verwendet, um Calcium-Signalgebung zugrunde liegenden Endothel-abhängige Vasodilatation in Arteriolen der narkotisierten Maus zu illustrieren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Distanz, über die ACh erhöht Endothelzellen Kalzium Fluoreszenz steigt mit der Intensität eines Rückschlags Strom aus dem microiontophoresis Mikropipette (Abbildung 3). Das Fehlen von Fluoreszenz-Anstieg unter Ruhebedingungen zeigt vernachlässigbar Austreten von ACh aus der Mikropipette. Der Mangel an Reaktion auf 100 nA Reizintensität (Abbildung 3, Legende) zeigt, dass eine Schwelle Intensität der Stimulation für Endothelzellen Kalzium zu erhöhen ist nicht erforderlich. Diese Techniken können ohne weiteres auf andere vasoaktive Substanzen und Gewebe Vorbereitungen angepasst werden. Praktische Überlegungen: In Zusammenarbeit mit microiontophoresis zu arteriolären Reaktivität Studie, einige Dinge sollten anerkannt werden. Während sie sich bewährt hat schwierig, die tatsächliche Konzentration des Agonisten geliefert zu bestimmen, sind Reiz-Reaktions-Kurven reproduzierbar innerhalb und zwischen den Präparaten. Diese können durch Halten Pulsdauer konstant (z. B. 500 ms) und die Variation der Auswurf Strom (; Abbildung 3 z. B. 250, 500 und 1000 nA) durchgeführt werden. Alternativ können Auswurf aktuellen konstant gehalten werden (zB 500 nA) und Pulsdauer variiert (z. B. 250, 500 und 1000 ms). Für einen Verweis auf die Aktionen eines definierten Agonistkonzentration kann die Zubereitung mit der entsprechenden Lösung 5 superfundiert werden. Da die treibende Kraft für gelöste Auswurf ist elektrische Ladung Bewegung, muss der Agent zu liefernden tragen eine Nettoladung von der Mikropipette verschoben werden. Um sicherzustellen, dass der Agent von Interesse primären Ladungsträger ist, wird es in hoher Konzentration (z. B. 1 M für ACh) aufgelöst, um Elektro-Osmose zu minimieren. Wenn diese Manipulation des pH-Wertes der Mikropipette Füllung Lösung erfordert, sind auf ein Fahrzeug steuert verpflichtet, eine unspezifische Effekte zu ermitteln. Entsprechende Kontrollen sollten auch für die Durchfahrt der aktuellen alleine durchgeführt werden (zB mittels Mikropipetten mit isotonischer Kochsalzlösung gefüllt). Die tatsächliche Reichweite für die Diffusion des Wirkstoffes aus dem Ort der Freisetzung sollte sichergestellt werden, und ist am ehesten empirisch durch das Verschwinden einer physiologischen Reaktion (z. B. Gefäßerweiterung oder ein Anstieg der intrazellulären Calcium auf Auswerfen der ACh) bestimmt als Mikropipette bei positioniert ist definierten Abständen aus der Ziel-Site. In der Praxis ist der effektive Diffusionsweg stark durch, wie die Spitze der Mikropipette wird im Gewebe positioniert beeinflusst, z. B. wenn die Spitze nach unten in das Gewebe und die Spitze gedrückt verschlossen ist, als Auswurf beeinträchtigt wird. Übermäßige Bindegewebe ist besonders problematisch und sollte von der Gewebeoberfläche bei chirurgischen Präparation entfernt werden. Augenmerk sollte auch auf die Möglichkeit, die zum Abbau der Spitze des Beauftragten gegeben werden. Dies wird durch relativ kurze Impulse (zB ≤ 1 s) minimiert. Bei anhaltend Strömen (zB einige Sekunden), kann die Agonisten von der Spitze vertrieben schneller sein, als es durch Diffusion aus der Schüttung Lösung in der Mikropipette ersetzt werden kann. Da vernachlässigbares Volumen mit microiontophoresis verdrängt wird, wenn man versucht, die lokale ionische Milieu zu ändern (zB um eine depolarisierende K liefern + Stimulus), kann dies nicht effektiv mit microiontophoresis erreicht werden, ist aber leicht mit Druck Ausstoß von Bulk-Flüssigkeit mit den gewünschten erreicht Zusammensetzung. Für die lokale Stimulation einer Arteriole, Arbeit Mikropipettenspitzen mit einem Innendurchmesser von 2-3 um auch mit Auswurf Pressure 4-5 psi (28-35 kPa) und Pulsdauer (zB 1 Sekunde) mit einem Magnetventil 10 gesteuert. Wo verzögerten Abgabe eines Agenten aus einer Mikropipette auf eine microvessel erforderlich ist, wird Druck Auswurf bevorzugt mit Mikropipetten geeignete interne Spitzendurchmesser (zB ~ 10 pm) 11,12. Eine hydrostatische Säule bekannter Höhe mit einem Absperrhahn bietet eine kostengünstige, on / off konstantem Druck Kopf gut definiert. Der Durchfluss durch den inneren Durchmesser der Pipettenspitze und der treibende Druck bestimmt. Wie immer, sind auf ein Fahrzeug steuert wichtig, unspezifische Maßnahmen der Druck Auswurf auszuschließen.

<table><tbody><tr><td> Verwendete Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Borosilikatglas Kapillarröhrchen </td><td> Warner Instruments </td><td> GC120F-10 </td><td></td></tr><tr><td> Horizontal Pipette Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modell P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Acetylcholinchlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6625 </td><td></td></tr><tr><td> Adapter für Luer-Hub </td><td> Martech </td><td> AC1343 </td><td> Um Mikrokapillare Schlauch sichern </td></tr><tr><td> 0,2 mu m Nylon Titan-Filter </td><td> So Sri </td><td> 42204-NN </td><td> Low Retentionsvolumen, um den Verlust zu minimieren </td></tr><tr><td> 5 ml Spritze </td><td> Becton-Dickinson Co. </td><td> 309603 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettenhalter </td><td> Warner Instruments </td><td> E45W-M12VH </td><td></td></tr><tr><td> Silver Wire </td><td> Warner Instruments </td><td> AG10W </td><td> 0,25 Durchmesser </td></tr><tr><td> 3-Achs-Mikromanipulator </td><td> Siskiyou Design-Instruments </td><td> DT3-100, MXB, MXC, MGB / 8 </td><td> Komponenten für Manipulator wie gezeigt </td></tr><tr><td> microiontophoresis aktuellen Programmierer </td><td> World Precision Instruments </td><td> Modell 260 </td><td></td></tr><tr><td> Auslöseeinrichtung </td><td> Brauch </td><td> Brauch </td><td> Schaltung versehen in Suppl. Abbildung 1 </td></tr><tr><td> Edelstahlplatte </td><td> McMaster-Carr </td><td> 1 / 8 &quot;X 12&quot; X 12 &quot; </td><td> Nach Konstruktion </td></tr><tr><td> Verstärkte Digital Camera </td><td> Stanford Photonics Inc. </td><td> XR/Mega-10 </td><td> Integriert mit Piper-Control-Software </td></tr></tbody></table>

microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation

Microiontophoresis bringt Stromdurchgang durch eine Mikropipette Spitze zu einer Lösung an einem bestimmten Ort zu liefern innerhalb einer experimentellen Vorbereitung. Microiontophoresis kann synaptischen Transmission 1 durch Bereitstellung von Neurotransmittern und Neuropeptiden auf Neuronen reproduzierbar 2 zu simulieren. Vernachlässigbares Volumen (Flüssigkeit) Verschiebung verhindert mechanische Störung des experimentellen Vorbereitung. Die Anpassung dieser Techniken, um die Mikrozirkulation 3 hat aktiviert Mechanismen der Vasodilatation und Vasokonstriktion auf der mikroskopischen Ebene in vivo 4,5 untersucht werden. Ein wesentlicher Vorteil einer solchen lokalisierte Abgabe ist damit vasomotorische Reaktionen auf an definierten Stellen innerhalb eines mikrovaskulären Netzwerk ohne evozieren systemischen oder reflexive Änderungen in Blutdruck und Gewebedurchblutung und verrät so intrinsischen Eigenschaften von Mikrogefäßen untersucht werden. Eine Einschränkung der microiontophoresis ist, dass die genaue Konzentration des Mittels auf die Baustelle geliefert von Interesse schwer zu ermitteln 6 ist. Dennoch, seine Entlassung aus der Mikropipette Spitze proportional zur Intensität und Dauer der Auswurf aktuellen 2,7 ist, kann, so dass reproduzierbare Reiz-Reaktions-Beziehungen leicht unter definierten experimentellen Bedingungen (siehe unten) ermittelt werden. Zusätzliche Faktoren, die microiontophoretic Lieferung mit Konzentration an gelösten Stoffen und deren Ionisierung in Lösung. Der Innendurchmesser der Mikropipette Spitze sollte ~ 1 um oder weniger sein, Diffusions &quot;Leck&quot;, die mit einem Sicherungsring aktuellen entgegengewirkt werden kann minimiert werden. So eine äußere (positive) Strom wird verwendet, um ein Kation und ein negativer Strom verwendet werden, um sie innerhalb der Mikropipette halten auszuwerfen. Herstellung von Mikropipetten mit ausgefeilten elektronischen Abzieher 8 erleichtert. Mikropipetten werden aus Glaskapillaren mit einem Filament, das gezogen wird &quot;Dochte&quot;-Lösung in die Spitze der Mikropipette, wenn sie aus dem Back-End (&quot;verfüllt&quot;) gefüllt. Dies wird durch das Einfügen eines Mikrokapillare Rohr verbunden, um eine Spritze mit der Lösung von Interesse und Auswerfen der Lösung in das Lumen der Mikropipette getan. Mikromanipulatoren ermöglichen gewünschte Platzierung der Mikropipetten innerhalb der experimentellen Vorbereitung. Mikromanipulatoren auf einem fahrbaren Untersatz montiert werden rund um die Zubereitung im Sinne der Topographie des mikrovaskulären Netzwerken (entwickelt unten) positioniert werden. Das vorliegende Protokoll zeigt microiontophoresis von Acetylcholin (ACh + Cl -) auf einer Arteriole der Maus cremaster Muskel-Präparat (siehe zugehörige Protokoll: JoVE ID # 2874) an Endothel-abhängige Vasodilatation zu erzeugen. Stimulus Lieferung mit digitalisierten Bildaufnahme mit einem elektronischen Auslöser synchronisiert. Die Verwendung von Cx40 BAC-GCaMP2 transgenen Mäusen 9 ermöglicht Visualisierung der intrazellulären Calcium-Reaktionen zugrunde liegenden Vasodilatation in Arteriolen Endothelzellen in den lebendigen Mikrozirkulation.

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Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis bringt Bewegung von Ionen aus einer Mikropipette in Reaktion auf eine Differenz des elektrischen Potentials zwischen den innerhalb und außerhalb der Mikropipette. Biologisch aktive Moleküle sind dabei im Verhältnis zur elektrischen Strom geliefert. Wir illustrieren Acetylcholin microiontophoresis in Verbindung mit Mikromanipulation an Endothel-abhängige Vasodilatation in der Mikrozirkulation zu untersuchen.

Microiontophoresis und Mikromanipulation für Intravital Fluoreszenz-Imaging der Mikrozirkulation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

microiontophoresis-micromanipulation-for-intravital-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K Aufrufe.  University of Missouri. Microiontophoresis bringt Bewegung von Ionen aus einer Mikropipette in Reaktion auf eine Differenz des elektrischen Potentials zwischen den innerhalb und außerhalb der Mikropipette. Biologisch aktive Moleküle sind dabei im Verhältnis zur elektrischen Strom geliefert. Wir illustrieren Acetylcholin microiontophoresis in Verbindung mit Mikromanipulation an Endothel-abhängige Vasodilatation in der Mikrozirkulation zu untersuchen.

Serie: Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

Geboren Normalisierung für Fluoreszenz-Optical Projection Tomographie für ganzem Herzen Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Forschung

Biologie

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie für In-vivo Imaging der Entwicklungsländer Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

Die Maus Cremaster Muscle Vorbereitung Intravital Imaging der Mikrozirkulation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Intravitalmikroskopie der Mikrozirkulation in der Maus Cremaster-Muskel für die Analyse der peripheren Stammzell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Schnelle Analyse und Exploration von Fluoreszenzmikroskopie Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Fluoreszenz-Imaging mit One-Nanometer-Genauigkeit (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Mikromanipulation Techniken Analyse der morphogenetischen Dynamik und Umsatz des Zytoskeletts Regulatoren

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

Isolation und Fluoreszenz-Imaging für Single-Particle-Rekonstruktion der Chlamydomonas Centriolen

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...