The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.

1. Bewertung der GI 50 für die Verbindung (en) in der Nähe <ol><li> Erzeugen Wachstumskurve (n) für die Zelllinien von Interesse, den entsprechende Aussaatdichte zu bewerten. Zeichnen Sie die Zellzahl zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Aussaat (Tage 2, 4, 6 und 8) in Bezug auf Tag 0. Dadurch wird eine relative Wachstumsrate der Zelllinie von Interesse bereitzustellen und sollte verwendet werden, um die anfängliche Aussaatdichte, so dass beurteilt werden Konfluenz in Platten mit 96 Vertiefungen innerhalb von 7 Tagen erreicht. </li><li> Einmal Wachstumskurven bestimmt worden sind, Saatgut geeignete Anzahl von Zellen in nicht-transparente, klare Bodenplatten mit 96 Vertiefungen in 100 &amp; mgr; l Zellmedium, um GI 50 beurteilen. Seed die Anzahl der Zellen auf der Grundlage der verwendeten Zelllinie und in 1,1 bestimmt. Typischerweise seed 3x10 3 Zellen für schnell wachsende Zelllinien mit einer Verdoppelung Zeit von ~ 24 Stunden, z. B. HCT116. <ol><li> Bereiten Sie eine Assayplatte (Tag-1). Für die Assay-Platte, Samenzellen im gewünschten Dichte in 100 ul Kulturmedium in Vertiefungen in blau schattiert (Abbildung 1). Wells markiert in weiß enthalten nur Medien. </li><li> Bereiten Sie eine Steuerplatte (Tag-1). Für die Steuerplatte, Samen der gleichen Zelldichte wie in Schritt 1.2.1 in 100 ul Kulturmedium in einem separaten 96-Well-Platte. Dieser &quot;Tag 0&quot; Messwert wird bei der Auslegung der zytostatischen / zytotoxischen Art der Verbindungen zu helfen, die analysiert wird (Abbildung 2). </li></ol></li><li> Am nächsten Tag (Tag 0), lesen Sie die Steuerplatte. Äquilibrieren Leucht Zellviabilität Reagenz (CellTiter-Glo Substrat mit Puffer nach den Anweisungen des Herstellers gemischt), um RT und vorsichtig invertiert Inhalte, um eine homogene Lösung zu erhalten. Werden 80 ul Reagenz zu den 100 ul Zell / Media-Mix und schütteln Inhalt 30 min auf Zelllyse induzieren. <ol><li> Nehmen Lumineszenz mit einem Luminometer, um einer Belichtung von 0,1 bis 1,0 sec und Detektionswellenlänge von 560 nm eingestellt. </li></ol></li><li> In Testverbindungen (Verbindungenvon Interesse), um Platten (Tag 0) testen. Machen Sie eine 1: 4 serielle Verdünnung von Verbindungen in DMSO bei 200-facher Endkonzentration für insgesamt 10 Konzentrationen (9 Verdünnungen haltigen Verbindung und einem DMSO nur, Verbindung Platte). Als Anfangsausgangspunkt, Ziel für eine 200x niedrigsten Dosis von 0,03 um und einem oberen Dosis von 2000 &amp; mgr; M (Endvolumen 200 ul). </li><li> In seriell verdünnt Verbindungen bis mittel, um eine Verbindung-Medium-Mix auf 10x Endkonzentration (Endvolumen 100 ul, Zwischenplatte) zu machen. Bewahren Sie die Verbindung Platte bei -20 ° C für den Einsatz am 3. Tag des Assays. Zugabe von 10 &amp; mgr; l der Verbindung Mittelmischung, um Zellen in dreifacher Ausführung, so dass die höchste Dosis von 10 uM (z. B. die Reihen B, C und D, Tag 0) (Abbildung 1). Inkubieren Testplatten für 3 Tage bei 37 ° C. Entsorgen Zwischenplatte (n) nach dem Gebrauch. </li><li> Am Tag 3, bereiten Sie einen 400 ul 1x Verbindung-Medium-Mix unter Verwendung der Verbindung in Platten 1.4 vorbereitet. Kehren Assayplatten Medien entfernen und trocken tupfen auf Autoclaved Papierhandtücher 2-3x Restmedien entfernen. In Verbindung / Medien (100 ul / Vertiefung) in die Vertiefungen in blau schattiert und fügen Sie 100 ul von Medien, um Umfang Brunnen, um Verdunstung (Abbildung 1) zu verhindern. Wieder inkubieren Testplatten bei 37 ° C für weitere 3 Tage. </li><li> Am Tag 6 beurteilen relative Anzahl an lebensfähigen Zellen durch Ausführen eines Lese Lumineszenz, wie in Schritt 1.3 beschrieben. </li><li> Verwenden Sie den Tag 0 Lesen, um die statische / toxische Natur der Verbindungen zu bewerten. Giftstoffe Apoptose der Erwägung, dass Zytostatika induziert Zellzyklusarrest. Wenn Verbindung toxisch ist (Tag 6 Messwert unter Tag 0 Lesung), prüfen, die Wahl GI 50 und GI 50 x 5-Konzentrationen für die Resistenz-Tests. Allerdings, wenn die Verbindung induziert Stasis (gleich oder höher ist als d0 Lesung), sollten GI 100 und GI 100 x5 für Widerstands Assays (Abbildung 2). </li></ol> 2. Einrichten Drug Resistance Assays <ol><li> Wenn Arbeits witha Zytostatikum, Samenzellen bei einer Konfluenz von 30-40% in 150 mm 2 Gewebekulturschalen (Volumen = 30 ml) für das Resistenzassay. Wenn die Arbeit mit einem toxischen Mittel, Saatgut zu einem 70-80% Zusammenfluss. </li><li> Für Zelllinien, die ein intaktes Mismatch-Reparatur (MMR) -Mechanismus beherbergen, Inkubation Zellen aus Schritt 2.1 O / N bei 37 ° C mit dem Karzinogen N-Ethyl-N-nitrosoharnstoff (ENU). Behandlung von Zellen mit 30 ul einer Stammlösung von 50 mg / ml ENU (Endkonzentration 50 ug / ml), um genomische Instabilität verstärken. Für Zelllinien, die eine defekte MMR (Tabellen 2 und 3), kann die Behandlung mit ENU oder andere Karzinogene nicht notwendig sein müssen. <ol><li> Für andere Zelllinien zu bestimmen MMR-Defizienz durch NCI Kriterien mittels Mikrosatelliteninstabilität 12 oder auf der veröffentlichten Charakterisierung mit Mikrosatelliten-Instabilität Assays oder genomische / epigenomischen Profilierung MMR-Genen 13-15 basieren. </li></ol></li><li> Genuss-Zellen mit der Testverbindung (en)Interesse an der Konzentration in Schritt 1.8 festgelegt. Für hochtoxische Verbindungen, die den Zelltod in einer typischen Drei-Tage-Lebensfähigkeitstest 10 führen, mit einer niedrigen Dosis-Behandlung (dh GI 50) beginnen und schrittweise zu erhöhen die Konzentration (ein Vielfaches von GI 50) der Verbindung alle 2-3 Wochen, bis robust Festigkeit zu beobachten ist. Aufzufüllen Medien und Verbindung alle 3 d. </li><li> Sobald die Auswahl erfolgt ist, dann Wechselmedien / Verbindung mischen alle 3-4 Tage, bis resistente Klone entstehen. Resistance per Definition ergibt sich, wenn behandelten Zellen zeigen mehr Wachstum / Lebensfähigkeit während der Medikamentenbehandlung in Bezug auf akute Behandlung von DMSO-behandelten Kontrollzellen. </li></ol> 3. Isolieren von Einzelzellklone <ol><li> Untersuchen Kulturschale unter Verwendung von Phasenkontrast-Mikroskopie (Vergrßerung 40x) lebensfähige Zellhaufen. </li><li> Filter zufriedenstellend Klone am Boden der Schale mit einem Markierungsstift. Pick-Klone, die von mittlerer Größe sind (größeren Kolonien kannstammen aus mehreren Zellen) und gut von anderen Kolonien isoliert. Pick-Klonen unter Verwendung eines der beiden Ansätze in Schritt 3.3 dargestellt. </li><li> Ansatz 1: Mit einer Pipette (Abbildung 3) <ol><li> Entfernen Wachstumsmedien und spülen Sie mit 1x PBS, alle schwimmenden Zellen zu entfernen. </li><li> Verwenden Sie schwarze Flecken als Führer zu &quot;pflücken&quot; Klonen mit Pipettenspitze (zur Pipette angebracht, p200 bevorzugt). </li><li> Transfer-Klone in 48-Well-Platten mit 200 ul frisches Medium (mit Halbverbindungskonzentration, um eine optimale Wiederherstellung von Zellen zu ermöglichen). </li><li> Lassen Sie Zellen für 2-3 Tage vor der Zugabe von 200 &amp; mgr; l frisches Medium / ideale Verbindungskonzentration zu erholen. </li><li> Weiter zum Medium / Verbindung wechseln alle 3-4 Tage und weiter, um Klone zu erweitern. </li></ol></li><li> Ansatz 2: Verwenden Cloning Discs (Abbildung 3) <ol><li> Markieren Sie Klonen, wie in Schritt 3.2 beschrieben. </li><li> Platzieren 3 mm Klonieren Scheiben in einer 10 cm-Gewebekulturschale mit 5 ml 0,25% trypsin-EDTA für 2 min. </li><li> Absaugen Medien aus Schale mit resistenten Klone und Overlay-Klone mit Trypsin getränkt Klonen Discs mit sterilen Einweg Pinzette. </li><li> Lassen Sie für 1-2 Minuten, je nachdem wie leicht Klone heben von den Platten, in einem 37 ° C Inkubator. </li><li> Pick up Klonen Discs mit einer sterilen Pinzette und Transfer in 48-Well-Platten mit 200 ul frisches Medium und die Hälfte Konzentration der Verbindung. </li><li> Pipette nach oben und unten vorsichtig, um die Zellen von Klonen Scheiben lösen und inkubieren O / N bei 37 ° C (lassen Sie das Klonen Scheiben in Brunnen). </li><li> Am nächsten Morgen, entfernen Sie die Klonen-Discs von 48-Well-Platten und füllt Vertiefungen mit 200 ul frisches Medium / Verbindung (Halb ideale Verbindungskonzentration). </li><li> Drei Tage später wieder aufzufüllen Medien mit der idealen Konzentration der Verbindung. </li><li> Weiter verändern Medien / Verbindung alle 3-4 Tage und weiter, um Klone zu erweitern. </li></ol></li></ol> 4. Bewertung Grad Reständigkeit der isolierten Klone <ol><li> Einmal 10-20 Kolonien werden expandiert, erzeugen GI 50 Kurven, wie in Schritt 1 beschrieben, um den Grad der Resistenz zu beurteilen. </li><li> Immer auch Kontrollpopulationen mit DMSO während des Auswahlprozesses behandelt. Es ist sehr wahrscheinlich, dass das Spektrum des Widerstandes geht, groß zu sein (etwas, das teilweise, während andere, die vollständige Resistenz). Sammeln einige Klone aus jeder dieser Klassen, da der Mechanismus der Resistenz kann zwischen den beiden Gruppen unterschiedlich sein. </li></ol> 5. Next-Generation-Sequencing- <ol><li> Spin down 2 Millionen Zellen (Kontrolle und resistente Klone) (500 xg für 5 min) in 15 ml konischen Röhrchen sowohl gDNA und RNA-Sammlung (also 2 x 2 Mio.). </li><li> Zweimal waschen mit 1x PBS und frieren Pellets in -80 ° C bis bereit für die Isolierung. </li><li> Verwenden Sie eine kommerzielle Extraktions-Kits zur RNA oder gDNA nach Herstellerprotokoll isolieren. </li><li> Proben für die Next-Generation-Sequenzierung abschickenVerwendung Anbieters Protokoll 10. </li></ol> 6. Bioinformatik Analyse der Proben (Ganz Exom-Sequenzierung) <ol><li> Vorverarbeitung Sequenzdaten nach Best-Practice-DNA-seq-Pipeline 16. <ol><li> Karte Alles liest menschlichen Genoms GRCh37 mit BWA 17 verweisen. Konvertieren Sie unkomprimierte SAM formatiert Ausrichtungen komprimiert BAM-Format mit samtools 18. Ausrichtungen Sortierung koordinieren mit samtools. In Lesegruppen mit Picard. (Für spezifische BWA, samtools und Picard befiehlt, siehe Zusatztext 1, Zeilen 1-4) </li><li> Markieren Sie alle Duplikate liest mit dem Befehl MarkDuplicates von der Picard-Werkzeugsatz 19. Index Diese Datei mit samtools. (Ergänzungstext 1, Zeilen 5-6) </li><li> Um übereinstimmende Basen Minimierung über alle liest, neu auszurichten lokal liest in Regionen beherbergen kleine Insertionen oder Deletionen unter Verwendung eines indel realigner 20. (Ergänzungstext 1, Zeilen 7-8) </li><li> Um die Accurac weiter zu verbesserny der Variante Berufung, empirisch Recalibrate Basisqualität Partituren mit einer Base Qualitätsfaktor Neukalibrierwerkzeug. Die Basisqualität Kalibrierwerkzeug sollte nicht nur korrekte Anfangsqualitätsfaktor, sondern auch berücksichtigen Kovariation von mehreren Funktionen, einschließlich lesen Gruppe, Maschinenzyklus, Grundstellung und Dinucleotid-Kontext (Vor- + Strom Basen) zu nehmen. Generieren Sie neu kalibriert BAM mit Picard PrintReads. (Für spezifische Befehle für diesen Schritt, siehe Zusatztext 1, Zeilen 9-10) </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6.1.1 bis 6.1.4 (Ergänzender Text 1, Zeilen 1-10) für jede Probe sequenziert. </li></ol></li><li> Identifizieren Sie Einzel-Nukleotid-Variation (SNV) in jedem Klon mit einem gekoppelten Variante ruft tool19, 21-23. Für jeden Klon sequenziert, ruft laufen gepaart Variante mit der elterlichen Klon als die ausgeglichene &quot;normal&quot;. (Ergänzende Text 1, Zeile 11) </li><li> Filtern sie wiederkehrende, qualitativ hochwertige Varianten und die Vorbereitungen für Annotation mit einer Variante Anmerkungswerkzeug 24. Deprioritize vaführungen nicht für alle resistenten Klone. (Siehe R-Skript im Ergänzungstext 2) </li><li> Anmerken Varianten mit einem Anmerkungswerkzeug 25, 26. Viele Variante Anmerkungswerkzeuge eine begleitende Web-App so dass Daten hochgeladen und von einem Remote-Server verarbeitet werden müssen. </li><li> Verwenden Sie einen funktionellen Auswirkungen Vorhersagewerkzeug 27-29, jene Varianten mit hohen funktionellen Auswirkungen vorhergesagt zu priorisieren. Wie Variante Annotation gibt verschiedene Tools für die funktionelle Auswirkungen Vorhersage über eine Web-Schnittstelle zur Verfügung. </li></ol>

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Publikationskosten für diesen Artikel werden von H3 Biomedizin gezahlt.

Auswahl der Zelllinie (n): Charakterisierung des genetischen Zustand und genomische Instabilität Zweifellos ist die absolut wichtigste Faktor bei der erfolgreichen Aufdeckung klinisch relevanter Resistenzmechanismen der ursprüngliche Zelllinie Auswahl. Zwei Faktoren berücksichtigt werden sollten. Zunächst wollen Zelllinie (n) des gleichen Linie / Subtyp beherbergen die definierenden genetischen Merkmalen der Krankheit zu wählen (z. B. BRAF V600E in Melanom). Abfrage der öffentlich verfügbaren transkriptomischen und Mutationsdaten für beide Zellinien 30-32 und primär / Metastasierung von Tumoren für eine Vielzahl von Indikationen 33,34 wird die Auswahl zu erleichtern. Obwohl Identifizierung von Zelllinien mit klinisch relevanten genetischen Veränderungen eignet, in einigen Fällen kann dies nicht möglich sein, aufgrund des Fehlens von verfügbaren Zellinien oder durchführbar aufgrund von Faktoren, wie die Schwierigkeit und die Länge des Screening-Prozesses. <p class="jove_content"&gt; Im Hinblick auf die zuvor genannten Punkt einen zweiten Faktor, der dann während der Zelllinienauswahl prüfen, ist die Leichtigkeit oder Durchführbarkeit Widerstand Screening mit der gewünschten Linie. So kann beispielsweise Faktoren wie Proliferation und intrinsische Mutationsraten einen enormen Einfluss auf die Geschwindigkeit der Entdeckung. Zu diesem Zweck können Zelllinien mit einem schnelleren Wachstum Kinetik und mangelhaft in DNA MMR Mechanismen in der Hoffnung verwendet, dass Entstehung spontaner Widerstand beschleunigt 35 werden. Basierend auf der kosmischen Datenbank gibt es mehrere Kandidaten-Zellinien mit einem Mangel in einer der zwei häufigsten mutierte MMR-Gene, MSH2 und MLH1 (Tabellen 2 und 3). Alternativ, wenn Zelllinien von Interesse nicht Lagerdefekte bestehen in MMR, akute Behandlung mit physikalischen oder chemischen Mutagenen DNA reaktive wie Alkylierungsmittel N-Ethyl-N -nitrosourea (ENU) verwendet, um genomische Instabilität verstärken. Obwohl beide Ansätze erheblich sHORTEN die Zeit, um resistente Klone erreichen und Nachbereitung Sequenzierung Stringente funktionellen Tests auf Kandidatengenen als eine größere Anzahl von nicht-funktionellen durchgeführt werden, sind Passagier Mutationen wahrscheinlich austreten. SNVs können Rangordnung, um die Chancen für die Identifizierung funktionell relevante Mutationen zu maximieren. Erstens, die Wahl diese Mutationen, die in unabhängigen Klonen wiederkehrende werden die Wahrscheinlichkeit, diese Mutationen sind Fahrer von Widerstand zu erhöhen. Im Falle wiederholten Mutationen nicht identifiziert werden, die sich auf SNVs dass der Mechanismus der Wirkung des Arzneimittels zu passen (beispielsweise das Target oder eine bekannte nachgeschalteten Effektor des Target) kann sinnvoll sein. Letztlich ist der Goldstandard immer experimentelle Evaluierung der verleih Aktivität der Kandidaten SNVs von Eileiter cDNA-Expression in Drogenempfindlichen Elternzellen. DNA vs RNA-Sequenzierung Sobald resistenten Klonen erzeugt wurden, DNA und / oder RNAkönnen je nach Bedarf sequenziert werden. DNA-Sequenzierung, entweder Exoms oder Vollgenomsequenzierung, wird Identifizierung der Keimbahn und somatischen Varianten, wie SNPs, indels ermöglichen und Nummer des Exemplars Varianten. Während die kostenfreundlich Exoms Sequenzierung konzentriert sich auf die Erzeugungs liest aus bekannten kodierenden Regionen, werden Gesamtgenom-Sequenzierung Daten für das gesamte Genom, die die Identifizierung von Mutationen in nicht-codierenden Elemente, wie Enhancer oder miRNAs 36 zu erleichtern, kann zu erzeugen. Da Genexpressionsdaten nicht während der DNA-Sequenzierung gemessen, ist es jedoch schwierig, die Mutation (en) wahrscheinlich eine funktionelle Fahrer vorherzusagen. In dieser Hinsicht ist die Sequenzierung von RNA, obwohl teurer, bietet diesen Vorteil. Die Tatsache, dass eine Mutation aufruf nur auf exprimierten RNA-Spezies durchgeführt erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass die Mutation von Interesse kann ein Funktionstreiber. Darüber hinaus ermöglicht eine gezieltere Befragung von Mutationen für Follow-up-Funktionstests, RNA-Sequenzierung auchbietet den zusätzlichen Vorteil, dass die Genexpression Veränderungen, alternative Spleißen und neuen chimären RNA-Spezies, einschließlich von Genfusionen, die auch als potente Fahrer Widerstand dienen kann, zu identifizieren. Bioinformatik Pipeline Beispiel Befehle werden zu Illustrationszwecken zur Verfügung gestellt, aber ausführlichere Dokumentation und Tutorials sind vom Broad Institute zur Verfügung 16 und sollte gründlich vor Beginn NGS Analyse gelesen werden. Die folgenden Befehle werden für eine UNIX-Shell-Umgebung auf einem System, auf dem alle Tools und Referenzdaten haben vorinstalliert konzipiert. Diese Befehle auch davon ausgehen, fastq Dateien mit Paired-End-Sequenz liest von zwei Proben mit dem Namen &quot;Eltern&quot; und &quot;resistent&quot;, haben Sie vom Anbieter eingegangen ist und sich im Verzeichnis &quot;data&quot; gesetzt. In den meisten Fällen sollten diese Befehle angepasst oder für eine bestimmte Anwendung, wobei Sie zusätzliche Befehlszeilen arg optimiert werdenkumente (zB das Hinzufügen &quot;-t 8&quot; auf den Befehl BWA ermöglicht Multithread-Betrieb über 8 CPU-Kerne). Lesegruppen (die Ausrichtungen, um biologische Proben zuzuordnen), müssen oft mit BAM-Dateien hinzugefügt werden, selbst wenn es nur eine Probe pro bam-Datei, um mit der Dateiformatanforderungen für bestimmte Werkzeuge entsprechen. Lesen Sie Gruppenparameter RGID, RGSM, RGPL, RGPU und RGLB können beliebige Zeichenfolgen den Beispielnamen beschreiben, Sequenzierung Plattform und Bibliothek-Strategie sein. In-vitro-vs in vivo-Assays Obwohl mehrere Resistenzmechanismen durch in vitro Selektion identifiziert wurden überprüft, um klinisch relevant, gibt es eine Möglichkeit, dass die Mechanismen können nicht als relevant oder überwiegende Mechanismen der klinischen Beständigkeit dienen. Ein Grund dafür kann eine wesentliche Rolle für die Mikroumgebung in Fahrwiderstand auf die Therapie, eine Komponente, die frei in dem Versuchsprotokoll / setup d umfassenbisher iscussed. Tatsächlich haben verschiedene Studien gezeigt, dass die Antikrebsmittel, die in der Lage sind, Tumorzellen zu töten unwirksam werden, wenn die Tumorzellen in Anwesenheit von Stromazellen impliziert angeborenen Resistenzmechanismen von Stroma 37,38 tragenen kultiviert werden. Um solche Stroma induzierte erworbenen Resistenzmechanismen zu identifizieren, kann man erwägen die Durchführung in vitro Co-Kultur oder in vivo Tumorresistenz Assays. Da erstere Assay ist ziemlich komplex, haben viele der Erzeugung von arzneimittelresistenten Tumor-Xenotransplantaten auf die potentielle Rolle des Stromas in Fahrwiderstand ansprechen gegriffen. Solche Studien beide identisch 5 und einzigartige 39 Resistenzmechanismen relativ zur in vitro-Selektion freigelegt, was bedeutet, dass das Stroma kann tatsächlich eine Rolle bei der letzteren spielen. Allerdings ist ein eingedenk der Länge der Zeit kann es zu ergreifen, um solche resistenten Tumoren zu erzeugen, und der Komplexität des Follow-up der Genomanalyse-complexitie sein müssens durch die intratumorale molekularen und zellulären Heterogenität. Zielidentifizierung Neben der Aufdeckung von Drogenresistenzmechanismen, kann dies NGS-basierte Genomprofilansatz auch angewendet werden, um zelluläre Ziele chemischer Sonden zu identifizieren. Historisch gesehen, mehrere unvoreingenommene Verfahren verwendet worden, um die zellulären Wirkmechanismen und Ziele der niedermolekularen Chemie mit biologischen Aktivitäten, einschließlich Affinitätsreinigung in Verbindung mit der quantitativen Proteomik, Hefe genomische Methoden, RNAi-Screening und Rechen Inferenz Ansätze 40 zu identifizieren. Als Erweiterung zum Aufklärung der Medikamentenresistenz-Mechanismen mit NGS-basierte genomische oder transkriptomischen Profilierung phänotypisch resistenten Zellpopulationen, die Identifizierung von einzigartigen wiederkehrenden Einzel-Nukleotid-Variationen (SNVs) oder Expression Veränderungen, die Widerstands aktivieren können Einblicke in die Funktions zellulären Ziele von Verbindungen bieten. Tsein basiert auf der Idee, dass ein Teil der beobachteten Widerstandsmechanismen rezidivierenden Mutationen in Genen, die die direkte Proteinziele des kleinen Moleküls kodieren behaftet sind. Vor kurzem validiert mehrere Berichte die Nützlichkeit des Ansatzes, vor allem durch die Kombination mit anderen Ansätzen, einschließlich Großkrebszelllinie Empfindlichkeit Profiling, um enthüllt die zellulären Ziele niedermolekularer Sonden 9,10.

Detaillierte molekulare Charakterisierung von Tumor Genome durch robuste Sequenzierungstechnologien und verbesserte Datenanalysewerkzeuge hat zur Entdeckung der wichtigsten genetischen Veränderungen in bestimmten Krebsarten 1,2 geführt. Entwicklung von gezielten Therapien bei diesen genetischen Läsionen, wie HER2, BCR-ABL, EGFR und ALK abzielen, haben sich deutlich verbessert die Lebensqualität für die Patienten 1,2. Doch trotz der Spezifität dieses Ansatzes, das klinische Ansprechen auf die meisten Einzeltherapien hat suboptimal war als Widerstand letztendlich entsteht. Vor kurzem hat bedeutende Fortschritte im Verständnis der molekularen Grundlagen der Resistenz gegen gezielte Therapeutika erzielt. Interessanterweise ist es immer klar, dass ein prominenter Mechanismus der Resistenz beinhaltet anhaltende Ziel / Signalweg-Aktivität. Als ein Beispiel dafür, Androgen-Rezeptor (AR) -dirigierten Enzalutamid Behandlung von Prostatakrebs führt zu Anreicherung von aktivierenden Mutationen im AR selbst, die Aufrechterhaltung AR-Signalisierung output in Gegenwart des Inhibitors 3-5. Diese Erkenntnis hat zu einer aggressiven Kampagne, um 1 LED) zu entwickeln Antagonisten der dritten Generation, die auch weiterhin sowohl WT und Mutanten-AR-Funktion in drücken kann Enzalutamid feste PCa 3 und 2) identifizieren potenzielle nachgeschaltete Knoten des AR-Signalisierung, die für eine therapeutische Intervention ausgerichtet werden kann . In ähnlicher Weise eine Resistenz gegen andere Klassen von Inhibitoren, wie jene für EGFR, BRAF und ABL häufig Mutationen, die die ursprüngliche süchtig-Kinase-Weg 1 Reaktivierung führen. Mit dem Wissen, dass der Widerstand zwangsläufig bei den meisten Patienten tritt, die Entwicklung von Konzepten, um zügig zu bringen, diese Mechanismen, um Licht Entwicklung wirksamer Follow-up-Therapien ermöglichen. Ein Ansatz, der vielfältig eingesetzt wird ist es, die Genomik von klinischen refraktären Tumoren in Bezug auf nicht vorbehandelten oder sensitiven Tumoren, um Anreicherungen / Abreicherungen in genetische Läsionen, die zugänglich d sein könnten analysierenTeppich Entdeckung. Trotz der Versprechen, gibt es zwei große Schulden dieser Vorgehensweise, die eine schnelle Entdeckung behindern. Erstens gewinnt rechtzeitigen Zugang zu Tumormaterial für genomische Verhör kann als eine wesentliche Hürde bei der Bewegung von der Therapie zur Heilung dienen. Zum anderen können die Entfaltung der Vielzahl von genetischen Läsionen in der beständigen Einstellung schwierig sein, da Tumoren signifikant intratumorale Heterogenität 6,7 präsentieren. Angesichts dieser Herausforderungen hat es auf präklinische Entdeckung von Resistenzmechanismen wurden verstärkt herangezogen. Dieser Ansatz kann Identifizierung von prominenten Resistenzmechanismen vor den klinischen Studien 1, die alternative klinische Managementstrategien bei Patienten, die diese Mechanismen entweder vor der Therapie oder nach dem Einsetzen des Widerstands tragen führen können zulassen. Eine solche präklinischen Discovery-Tool, das in großem Umfang verwendet wird, ist es, unvoreingenommene funktionelle RNAi-Screens gelten. Für Prüfungsweise Whittaker und Kollegen angewandt eine genomweite RNAi-Bildschirm zu erkennen, dass NF1 Verlust vermittelt Resistenz gegen RAF und MEK-Inhibitoren durch nachhaltige MAPK Signalweg-Aktivierung 8. Diese Ergebnisse wurden gefunden, um klinisch relevant wie loss-of-function Mutationen im NF1 wurden in BRAF -Mutante Tumorzellen, die intrinsisch resistent gegen RAF-Hemmung und in Melanomtumoren beständig Aktivierung 8 Vemurafenib sind beobachtet. Trotz des Erfolgs dieser Ansatz vielen klinisch relevanten Ziele werden häufig nicht identifiziert, vermutlich aufgrund der Loss-of-function-Vorspannung dieses Ansatzes. Im Gegensatz dazu ist eine weniger voreingenommen Werkzeug für präklinische Entdeckung von Resistenzmechanismen beinhaltet die Erzeugung von resistenten Zelllinien bei längerer Exposition gegenüber Verbindung von Interesse verbunden mit NGS-basierte genomische oder Transkriptom-Profiling. Dieser Ansatz wurde von mehreren Gruppen durchgeführt, um zu ermitteln spontanewiederkehrende Einzel-Nukleotid-Varianten oder Ausdruck Veränderungen, die Widerstands 5,9,10 zu ermöglichen. Zum Beispiel wurde ein wiederkehrendes F876L Mutation AR kürzlich resistente Klone in vitro 3-5 und in Xenotransplantat-Tumoren in vivo 5 vor der Identifizierung der Mutation in der Klinik 4 entdeckt. Erst kürzlich Bhang und Kollegen (2015) 11 in zwei klinisch relevanten Modellen verwendet ClonTracer, dass Mehrheit der resistente Klone, die während der verlängerten Arzneimittelexposition entstehen, waren Teil einer bereits bestehenden Subpopulation darauf hindeutet, dass die meisten funktionell relevante Mutationen zeigen, sind wahrscheinlich bereits vorbestehenden dass geworden für die bei der Auswahl 11 ausgewählt. Im Gegensatz zu der genomischen Profilierungs von Tumoren früher diskutiert, dieser Ansatz wird zudem weniger Heterogenität als &quot;homogene&quot; resistente Klone werden zur Analyse verwendet Erleichterung genauer Genetik der potentielle Fahrer. FurthermErz, aufregend, zusätzlich zu dem Potential für die Aufdeckung Resistenzmechanismen, kann dieses Verfahren auch angewendet werden, um die zellulären Mechanismen der Wirkung und Targets von bioaktiven kleinen Molekülen für die diese Information nicht bekannt ist 10 identifizieren. Angesichts der klaren Vorteile und die Mehrfachnutzung von diesem Ansatz, hier präsentieren wir ein Protokoll Detaillierung erfolgreiche Umsetzung eines solchen präklinischen Bildschirm, um das Potential für klinisch bedeutsame Entdeckungen zu maximieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-86&#160;</td>
			<td>Expanding clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-588</td>
			<td>Generating GI50 curves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning discs (3 mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z374431</td>
			<td>Picking clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile forceps</td>
			<td>Unomedical</td>
			<td>DF8088S</td>
			<td>Picking clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>Isolating RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Tissue DNeasy extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69581</td>
			<td>Isolating gDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATK</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Indel realigner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MuTect</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Paired variant calling tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncotator</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Variant annotation tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MutationAccessor</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Functional impact prediction tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of in vitro drug resistance assays: maximizing the potential for uncovering clinically relevant resistance mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Um das Potenzial für die Entdeckung der wichtigsten Funktionstreiber des Widerstands zu maximieren, wählen Sie Einzelzellklone für die Expansion, phänotypische Tests und Sequenzierung. Wie in 4A dargestellt ist, HCT116-Zellen über einen längeren Zeitraum mit einer zytotoxischen Verbindung # 1 führte zur spontanen Entstehung resistenter Klone, die bei der Behandlung (gestrichelte schwarze Kreise) wachsen weiter behandelt. Diese Klone wurden mit Ansatz # 1 die in Abbildung 3 und anschließend für phänotypische Analysen expandiert gerichtet. Wie in 4B gezeigt ist, resistente Klone 1-3 zeigten alle signifikanten Widerstand in die Verbindung # 1 und die enge analoge Verbindung # 2 (größere Lebensfähigkeit / Wachstum), alle Klone zeigten eine Empfindlichkeit gegenüber einem nicht verwandten zytotoxische Verbindung VELCADE. Nach der Bestätigung der phänotypischen Resistenz, gDNA wurde isoliert und für die Ganz Exom-Sequenzierung Analyse unterzogen. Bioinformatik-Tools wurden angewandt, um auf diesen Strukturvarianten einzugrenzen, dasssind 1) wiederkehrende und 2) haben das Potenzial für funktionelle Auswirkungen (5A). Strukturvarianten, die diese beiden Kriterien erfüllt wurden von einem unabhängigen Sequenzierungswerkzeug bestätigt. Wie in 5B, einem heterozygoten Missense-Mutation, die mit Ganz Exoms Sequenzierung wurde mit der Sanger-Sequenzierverfahren bestätigt identifiziert wurde, dargestellt (obere Tafel, WT Sequenz; untere Platte, mutierten Sequenz). Nach Sequenzbestätigung, die elterliche Zelllinie, die ursprünglich für den Widerstand Test verwendet wurde gentechnisch verändert, um das mutierte cDNA exprimieren funktionell bestätigen die Rolle der Mutation. Wie in Figur 6 dargestellt, während die Überexpression des WT cDNA konnte Resistenz, erzwungene Expression der mutierten cDNA deutlich tragenen phänotypischen Resistenz zu Verbindung # 1, bestätigt die funktionelle Rolle dieses Strukturvariation als Fahrer des Widerstands. Alle Reagenzien für dieses Experiment sind in der Tabelle 1 umrissen </s<html> trong&gt;. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig1.jpg" /> Abbildung 1. Aufbau des Assays und Steuerplatten. Blauton, Verbindung Behandlung Brunnen. Weiß Schatten, nur Medium. Verbindungen werden seriell verdünnt 1: 4 und in Triplikaten (BD oder EG) verabreicht. 2 Verbindungen pro Platte aufgebracht werden. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Lebensfähigkeit Kurven. Rot gepunktete Linie stellt den Tag 0 Lesen. X-Achse zeigt die steigende Dosen der Verbindung nach rechts und y-Achse relativ zur Lebensfähigkeit DMSO Kontrollvertiefungen darstellt. GI 100 = Dosis verwendet werden, um 100% Wachstumshemmung zu erreichen; GI 50 = Dosis verwendet werden, um die Lebensfähigkeit von 50% des DMSO-Kontrolle zu reduzieren. _upload / 52.879 / 52879fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. Zwei Ansätze für die Kommissionierung resistente Klone für Expansion. Anfahrt 1- Verwendung Pipette abholen und Transfer gut definierten Klone auf 48-Well-Platten. Ansatz 2- Verwendung Trypsin getränkten Klonierung Scheiben, um Klone zu heben und zu übertragen, um Platten mit 48 Vertiefungen. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig4.jpg" /> Figur 4. Bestätigung der für HCT116-Klonen erreicht werden, um Verbindung # 1 in vitro-Resistenz. (A) Verbindung # 1 beständigen HCT116 Klone entstanden folgende kontinuierliche dreiwöchigen Selektion. (B) Die Lebensfähigkeit der Kontrolle und resistente Klone wurden nach 72 h Behandlung mit verschiedenen Verbindungen getestet. Verbindung # 2 ist ein enger Analogon von Verbindung # 1. Bortezomib wurde als Kontrolle zytotoxische Mittel verwendet. Die Daten sind als mittlere + Standardabweichung von drei biologischen Wiederholungen gezeigt. Abbildung 5. Identifizierung eines einzigartigen, wiederkehrende Mutation (Einzel-Nukleotid-Varianten, SNVs) im Gen A in Verbindung # 1 feste HCT116 Klone. (A) Arbeitsablauf in allen resistenten Klonen vorhanden SNVs identifizieren und vorhergesagt, dass eine hohe funktionelle Auswirkungen haben von MutationAssessor. (B) Bestätigung der Mutation im Gen für eine durch die Sanger-Sequenzierung. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig6.jpg" /> Abbildung 6. Re-Expression des mutierten Gens A tragenen Widerstand zu Verbindung # 1 in vitro. Die Lebensfähigkeit der engineered HCT116-Zelllinien wurde nach 72 h Behandlung mit der Verbindung # 1 getestet. HCT116-WT oder mutierten Zellinien werden stabil exprimierende WT oder mutierten cDNAs von Gen A verbunden. Die Daten sind als mittlere + Standardabweichung o gezeigtf drei biologischen Replikaten. <table><tbody><tr><td> Sample Name </td><td> Aminosäure </td><td colspan="2"> Primärgewebe </td><td> Zygosität </td></tr><tr><td> C-33-A </td><td> p.E768fs * 44 </td><td colspan="2"> Gebärmutterhals </td><td> Heterozygot </td></tr><tr><td> C-33-A </td><td> p.S860 * </td><td colspan="2"> Gebärmutterhals </td><td> Heterozygot </td></tr><tr><td> CML-T1 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygot </td></tr><tr><td> CP66-MEL </td><td> p.C822F </td><td colspan="2"> Haut </td><td> Heterozygot </td></tr><tr><td> CTV-1 </td><td> P.0? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygot </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> p.Q130fs * 2 </td><td colspan="2"> Eierstock </td><td> Heterozygot </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> Eierstock </td><td> Heterozygot </td></tr><tr> &lt;td&gt; HCC2218 </td><td> p.E467K </td><td colspan="2"> Brust </td><td> Heterozygot </td></tr><tr><td> J-RT3-T3-5 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygot </td></tr><tr><td> LNCaP </td><td> p.? </td><td colspan="2"> Prostata </td><td> Homozygot </td></tr><tr><td> LoVo </td><td> p.? </td><td colspan="2"> Dickdarm </td><td> Homozygot </td></tr><tr><td> MOLT-13 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygot </td></tr><tr><td> NALM-6 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygot </td></tr><tr><td> NCI-H630 </td><td> p.R680 * </td><td colspan="2"> Dickdarm </td><td> Heterozygot </td></tr><tr><td> Skut-1 </td><td> p.L787fs * 11 </td><td colspan="2"> Endometrium </td><td> Homozygot </td></tr><tr><td> Skut-1B </td><td> pL787fs * 11 </td><td colspan="2"> Endometrium </td><td> Homozygot </td></tr><tr><td> SUP-T1 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygot </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 MSH2 -mutated Zelllinien. Zelllinie (Probenname), Aminosäuresubstitution, die Linie der Herkunft und die Zygotie angegeben. <table><tbody><tr><td> Sample Name </td><td> Aminosäure </td><td colspan="2"> Primärgewebe </td><td> Zygosität </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> p.R100 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Heterozygot </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Heterozygot </td></tr><tr><td> CW-2 </td><td> p.Y130fs * 6 </td><td colspan="2"> Dickdarm </td><td> Homozygot </td></tr><tr><td> DU-145 </td><td> p.? </td&gt; <td colspan="2"> Prostata </td><td> Homozygot </td></tr><tr><td> GR-ST </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygot </td></tr><tr><td> HCT-116- </td><td> p.S252 * </td><td colspan="2"> Dickdarm </td><td> Homozygot </td></tr><tr><td> IGROV-1 </td><td> p.S505fs * 3 </td><td colspan="2"> Eierstock </td><td> Homozygot </td></tr><tr><td> MN-60 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygot </td></tr><tr><td> NCI-SNU-1 </td><td> p.R226 * </td><td colspan="2"> Bauch </td><td> Homozygot </td></tr><tr><td> P30-OHK </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygot </td></tr><tr><td> PR-Mel </td><td> p.? </td><td colspan="2"> Haut </td><td> Homozygot </td></tr><tr><td> REH </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td&gt; <td> Homozygot </td></tr><tr><td> SK-OV-3 </td><td> P.0? </td><td colspan="2"> Eierstock </td><td> Homozygot </td></tr><tr><td> SNU-1544 </td><td> p.S2L </td><td colspan="2"> Dickdarm </td><td> Heterozygot </td></tr><tr><td> SNU-1746 </td><td> p.E523K </td><td colspan="2"> Dickdarm </td><td> Homozygot </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.C233R </td><td colspan="2"> Pankreas </td><td> Heterozygot </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> Pankreas </td><td> Heterozygot </td></tr><tr><td> SNU-478 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> Pankreas </td><td> Heterozygot </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. MLH1 -mutated Zelllinien. Zelllinie (Probenname), Aminosäuresubstitution, die Linie der Herkunft und die Zygotie angegeben.

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Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug Resistenz gegen gezielte Therapeutika ist weit verbreitet und die Notwendigkeit, die Mechanismen der Resistenz zu identifizieren - vor oder nach dem klinischen Einsetzen - ist entscheidend für die Führung alternative klinische Management-Strategien. Hier präsentieren wir ein Protokoll zu koppeln, Ableitung von Medikamenten-resistenten Linien in vitro mit Sequenzierung zur Entdeckung dieser Mechanismen zu beschleunigen.

Implementierung von<em&gt; In-vitro-</em&gt; Drug Resistance Assays: Maximierung des Potenzials für die Aufdeckung klinisch relevanter Resistenzmechanismen

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

10.4K Aufrufe.  H3 Biomedicine.  Drug Resistenz gegen gezielte Therapeutika ist weit verbreitet und die Notwendigkeit, die Mechanismen der Resistenz zu identifizieren - vor oder nach dem klinischen Einsetzen - ist entscheidend für die Führung alternative klinische Management-Strategien. Hier präsentieren wir ein Protokoll zu koppeln, Ableitung von Medikamenten-resistenten Linien in vitro mit Sequenzierung zur Entdeckung dieser Mechanismen zu beschleunigen. 

Serie: Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

Beurteilung Myogenic Antwort und Vasoaktivität In Resistance Mesenterialarterien Mit Druck Myographie

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Forschung

Medizin

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell cultures that preserve the genomic profile of the parental tumors, for use in patient specific in vitro and in vivo models, has the potential to revolutionize the preclinical development of new treatments for glioblastoma tailored to the molecular characteristics of each tumor.
Starting with fresh high grade astrocytoma tumors dissociated into single cells, we use the neurosphere assay as an enrichment method for cells presenting cancer stem cell phenotype, including expression of neural stem cell markers, long term self-renewal in vitro, and the ability to form orthotopic xenograft tumors. This method has been previously proposed, and is now in use by several investigators. Based on our experience of dissociating and culturing 125 glioblastoma specimens, we arrived at the detailed protocol we present here, suitable for routine neurosphere culturing of high grade astrocytomas and large scale expansion of tumorigenic cells for preclinical studies. We report on the efficiency of successful long term cultures using this protocol&#160;and suggest affordable alternatives for culturing dissociated glioblastoma cells that fail to grow as neurospheres. We also describe in detail a protocol for preserving the neurospheres 3D architecture for immunohistochemistry. Cell cultures enriched in CSCs, capable of generating orthotopic xenograft models that preserve the molecular signatures and heterogeneity of GBMs, are becoming increasingly popular for the study of the biology of GBMs and for the improved design of preclinical testing of potential therapies.

Protocol for propagation of dissociated high grade glioma surgical specimens in serum-free neurosphere medium to select for cells with cancer stem cell phenotype. For specimens that fail to grow as neurospheres, an alternative protocol is suggested. A paraffin embedding technique for maintaining the 3D neurosphere architecture for immunocytochemistry is described.

Optimierung der hochwertigen Gliom-Zellkultur von chirurgischen Proben für den Einsatz in klinisch relevanten Tiermodellen und 3D-Immunchemie

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

Eine erschwingliche HIV-1 Drug Resistance Überwachungsmethode für Ressourcen Begrenzte Einstellungen

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these diseases. Chronic retinal diseases such as retinal oedema or neovascularization usually require multiple intraocular injections to effectively treat the condition. However, the risks associated with these injections increase with repeated delivery of the drug. Therefore, alternative delivery methods need to be established in order to minimize the risks of reinjection. Several other investigations have developed methods to deliver drugs over extended time, through materials capable of releasing chemicals slowly into the eye. In this investigation, we outline the use of Elvax 40W, a copolymer resin, to act as a vehicle for drug delivery to the adult rat retina. The resin is made and loaded with the drug. The drug-resin complex is then implanted into the vitreous cavity, where it will slowly release the drug over time. This method was tested using 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), a glutamate analogue that blocks the light response of the retina. It was demonstrated that the APB was slowly released from the resin, and was able to block the retinal response by 7 days after implantation. This indicates that slow-release drug delivery using this copolymer resin is effective for treating the retina, and could be used therapeutically with further testing.

This paper details how Elvax 40W can be used as a slow-release method for drug delivery to the adult rat retina. The protocol for preparing, loading, and delivering the drug-resin complex to the eye is described.

Slow-Release-Drug Delivery durch Elvax 40W, um die Ratte Retina: Implikationen für die Behandlung von chronischen Erkrankungen

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Gentransfer-Technik und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Zellbasierte Assays für das Studium der Knochenverlust in Skeletterkrankungen

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Bewertung der Wirksamkeit der Krebsmedikament Sensibilisierung<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Adapted Resistance Training Improves Strength in Eight Weeks in Individuals with Multiple Sclerosis

Hip weakness is a common symptom affecting walking ability in people with multiple sclerosis (MS). It is known that resistance strength training (RST) can improve strength in individuals with MS, however; it remains unclear the duration of RST that is needed to make strength gains and how to adapt hip strengthening exercises for individuals of varying strength using only resistance bands. This paper describes the methodology to set up and implement an adapted resistance strength training program, using resistance bands, for individuals with MS. Directions for pre- and post-strength tests to evaluate efficacy of the strength-training program are included. Safety features and detailed instructions outline the weekly program content and progression. Current evidence is presented showing that significant strength gains can be made within 8 weeks of starting a RST program. Evidence is also presented showing that resistance strength training can be successfully adapted for individuals with MS of varying strength with little equipment.

Hip weakness is a common symptom affecting walking ability in people with multiple sclerosis. Isolated muscle strengthening is a useful method to target specific weaknesses. This protocol describes a progressive resistance-training program using exercise bands to increase hip muscle strength.

Angepasst Krafttraining verbessert die Festigkeit in acht Wochen bei Patienten mit Multipler Sklerose

Hip weakness is a common symptom affecting walking ability in people with multiple sclerosis (MS). It is known that resistance strength training (RST) can ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to hypoxia sensitive organs such as the brain, compensatory circulatory mechanisms help to maintain an adequate oxygen supply. This is mainly achieved by increased cerebral blood flow. Intermittent hypoxia is a commonly seen phenomenon in patients with obstructive sleep apnea. Acute airway obstruction can also result in hypoxia and hypercapnia. Until now, no adequate model has been established to simulate these dynamics in humans. Previous investigations focusing on human hypoxia used inhaled hypoxic gas mixtures. However, the resulting hypoxia was combined with hyperventilation and is therefore more representative of high altitude environments than of apnea. Furthermore, the transferability of previously performed animal experiments to humans is limited and the pathophysiological background of apnea induced physiological changes is poorly understood. In this study, healthy human apneic divers were utilized to mimic clinically relevant hypoxia and hypercapnia during apnea. Additionally, pulse-oximetry and Near Infrared Spectroscopy (NIRS) were used to evaluate changes in cerebral and peripheral oxygen saturation before, during, and after apnea.

Hypoxia simulation in humans has usually been performed by inhaling hypoxic gas mixtures. For this study, apneic divers were used to simulate dynamic hypoxia in humans. Additionally, physiological changes in desaturation and re-saturation kinetics were evaluated with non-invasive tools such as Near-Infrared-Spectroscopy (NIRS) and peripheral oxygenation saturation (SpO2).

Ein Modell Simulieren von klinisch relevanter Hypoxie beim Menschen

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

A Cell Culture Model of Resistance Arteries

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and signaling processes that can control vascular tone and blood pressure. As it is a projection from either the endothelial or smooth muscle cell, and due to its small size (on average, an area of ~1 &#181;m2), the MEJ is difficult to study in isolation. However, we have developed a cell culture model called the vascular cell co-culture (VCCC) that allows for in vitro MEJ formation, endothelial cell polarization, and dissection of signaling proteins and processes in the vascular wall of resistance arteries. The VCCC has a multitude of applications and can be adapted to suit different cell types. The model consists of two cell types grown on opposite sides of a filter with 0.4 &#181;m pores in which the in vitro MEJs can form. Here we describe how to create the VCCC via plating of cells and isolation of endothelial, MEJ, and smooth muscle fractions, which can then be used for protein isolation or activity assays. The filter with intact cell layers can be fixed, embedded, and sectioned for immunofluorescent analysis. Importantly, many of the discoveries from this model have been confirmed using intact resistance arteries, underscoring its physiological relevance.

A cell culture model of resistance arteries is described, allowing for the dissection of signaling pathways in endothelium, smooth muscle, or between endothelium and smooth muscle (the myoendothelial junction). The selective application of agonists or protein isolation, electron microscopy, or immunofluorescence can be utilized using this cell culture model.

Eine Kultur Zellmodell der Widerstand Arterien

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

Bewertung der vaskulären Kontrollmechanismen Nutzung Videomikroskopie der isolierten Widerstand Arterien von Ratten

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...