Knorpelimplantate stellen eine translationale, leicht zugängliche Methode zur Rückfragen zur Gewebeumgestaltung in der Knorpelmatrix dar. Die Methode kann einen frühen Einblick in die Auswirkungen potenzieller neuer Behandlungen auf die Gelenkstruktur geben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass dieser Knorpel in einer nativen 3D-Umgebung verbleibt, die eine Profilerstellung der Interaktion zwischen Zellen und der umgebenden Matrix mit Biomarkern ermöglicht.
Das Prinzip in der Methode ist nicht nur Knorpel. Explanten können aus anderen Geweben wie einem Ovium, Leber und Lunge extrahiert und mit Matrix-abgeleiteten Biomarkern abgefragt werden. Demonstriert wird das Verfahren von Amalie Engstrom, einer Grad-Studentin aus unserem Labor.
Führen Sie den gesamten Gewebebeschaffungsprozess außerhalb einer laminaren Strömungshaube in einer aseptischen Umgebung durch. Von einem lokalen Schlachthof erhalten Sie ein ganzes frisches rindertibiales Oberschenkelkniegelenk von Kälbern zwischen 1,5 und zwei Jahren. Dann sezieren Sie das Wadenknie sanft, indem Sie zuerst das überschüssige Fleisch entfernen und die Kondylen, den Meniskus, die Sehnen und die Synovialmembran aufdecken.
Schneiden Sie die Sehnen und die Synovialmembran, so dass sich das Gelenk zerlegen kann. Entfernen Sie den Meniskus, um die Femoralkondylen zu entblößen. Verwenden Sie einen Drei-Millimeter-Biopsie-Stanzer, um Expflanzen aus dem tragenden Bereich der Femoralkondylen zu isolieren und sie von der auricularen Oberfläche freizusetzen, indem Sie mit einem Skalpell parallel zum subchondralen Knochen schneiden.
Die Expflanzen in DMEM F12 glutimax Kulturmedium, das 1%Penicillin und Streptomycin enthält, sofort in einer 50-Milliliter-Röhre oder Petrischale aufbewahren und mischen. Um mit der Gewebekultivierung zu beginnen, übertragen Sie die Expflanzen auf eine sterile 96-Wellplatte in einer laminaren Strömungshaube, die alle Replikationen innerhalb jeder Gruppe diagonal platziert, um die durch Verdunstung induzierte Variation zu minimieren. Fügen Sie PBS zu den äußeren Brunnen der Kulturplatte hinzu, um eine weitere Verdunstung des Überstandes zu vermeiden.
Dann waschen Sie die Explants dreimal entweder in Kulturmedium oder PBS. Kultur die Explants in 200 Mikroliter Kultur Medium pro Brunnen bis zum Beginn des Experiments für bis zu 10 Wochen in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Wenn Sie irgendwelche Behandlungen anwenden, bereiten Sie diese auf die gewünschte Konzentration in den Explantbrunnen durch Verdünnung im Kulturmedium vor dem Wechsel des Mediums vor.
Ändern Sie das Kulturmedium alle zwei bis drei Tage in einer laminaren Strömungshaube. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig von jedem Brunnen und übertragen Sie ihn zur Lagerung auf eine neue 96-Wellplatte. Sofort 200 Mikroliter frisches Kulturmedium oder Behandlung zu jedem Brunnen hinzufügen.
Lassen Sie die Explants während des mittleren Wechsels nicht austrocknen und stellen Sie sicher, dass alle Expflanzen vollständig in das neue Medium getaucht sind. Versiegeln Sie die neue Platte mit Dichtband und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius für die Biomarkeranalyse des Gewebeumsatzes und der Proteinexpression. Um einen Resazurin-Test zu beginnen, machen Sie eine Lösung von Kulturmedium mit 10%resazurin.
Ernten Sie den Überstand wie zuvor beschrieben und tauchen Sie die Expflanzen in die 10%resazurin Lösung bei 37 Grad Celsius für drei Stunden oder bis die Überräube lila werden. Übertragen Sie dann die konditionierte und Hintergrundsteuerung Resazurin-Lösung auf eine schwarze Mikrotiterplatte und messen Sie die Fluoreszenz bei einer Anregung von 540 Nanometern und einer Emission von 590 Nanometern. Danach tauchen Sie die Ex-Pflanzen für fünf bis zehn Minuten in Waschmedium, damit das Resazurin vollständig ausdiffus ist und bei Verwendung ein neues Kulturmedium oder Behandlungen hinzufügt.
Messen Sie die Stoffwechselaktivität einmal wöchentlich als indirekte Messung der Zelllebensfähigkeit. In dieser Studie werden Rinder-Expflanzen mit voller Tiefe isoliert, kultiviert und behandelt. Explanten werden in vier Gruppen für die Behandlung unterteilt, einschließlich der mit Oncostatin M und Tumornekrosefaktor alpha behandelten, der mit Oncostatin M und dem Tumornekrosefaktor alpha mit GM 6001 behandelten, der mit Insulinwachstumsfaktor eins behandelten Und einer Kontrolle ohne Behandlung.
Die Stoffwechselaktivität ist während der drei Wochen für alle vier Gruppen relativ stabil. Es gab eine Tendenz für IGF-1 zu erhöhen und O plus T-Gruppen im Vergleich zur Kontrolle zu verringern. O plus T wird dann dreimal pro Woche auf Kulturbrunnen angewendet, um o plus T vermittelte Knorpeldegradation zu untersuchen.
O plus T wird gesehen, um Typ zwei Kollagen Abbau von Tag sieben bis 21 und Aggrecan Abbau von Dentagen drei bis 14 im Vergleich zur Kontrollgruppe zu erhöhen. Das Hinzufügen von GM 6001 in Kombination mit O plus T blockiert die Veröffentlichung des O plus T vermittelten C2M, hat aber nur begrenzte Auswirkungen auf AGN X1 mit ähnlichen Werten wie O plus T Gruppe an Tag 10. Insulin wie Wachstumsfaktor eins wird dreimal wöchentlich auf Rinder volltief Explanten angewendet, um zu untersuchen, wie anabole Stimulation Module den Knorpel ECM Umsatz.
Die Wirkung von IGF-1 auf die Knorpelexplantationen wurde hauptsächlich bei Messungen der Kollagenbildung typ2 beobachtet, wie für anabole Reize erwartet. Bei der Behandlung mit IGF-1, die Pro-C2-Spiegel verringern sich weniger als die in der Kontrollgruppe beobachtet, was darauf hindeutet, dass IGF-1 stimuliert Typ zwei Kollagenbildung von Tag sieben. Explants können sich im Laufe der Zeit verschlechtern und daher ist eine sorgfältige Pipettierung bei allen Behandlungs- und Waschschritten von entscheidender Bedeutung, um Expflanzen in den verschiedenen Medienaustauschschritten nicht zu verlieren oder zu zerstören.
Die mit diesem Modell generierten Ergebnisse sollten nicht allein stehen, sondern durch Daten unterstützt werden, die sowohl im menschlichen Gewebe als auch in zellulären und in neueren Modellen generiert werden, um die Ergebnisse weiter zu validieren. Um den zugrunde liegenden Mechanismus im Gewebe und nicht nur die Ergebnisse zu beleuchten, ist es möglich, sowohl Gewebe als auch Überstände mit anderen molekularbiologischen Techniken wie Gen- und Proteinexpressionsanalyse oder Immunhistochemie oder anderen permanenten molekularbiologischen Techniken weiter zu analysieren.
