Хрящ имплантаты представляют собой переводный легко доступный метод для допроса ткани ремоделирования в матрице хряща. Метод может обеспечить раннее понимание того, как потенциальные новые методы лечения влияют на структуру суставов. Основным преимуществом этого метода является то, что хрящ остается в родной 3D-среде, что позволяет профилировать взаимодействие между клетками и окружающей матрицей с помощью биомаркеров.
Принцип в методе не уникален для хряща. Экспланты могут быть извлечены из других тканей, таких как овий, печень и легкие и допрошены с помощью матрицы производных биомаркеров. Демонстрацией процедуры будет Амали Энгстром, аспирант из нашей лаборатории.
Выполните весь процесс поиска тканей за пределами ламинарного капюшона потока в асептической среде. С местной скотобойни, получить весь свежий бычий трибиальный бедренной коленного сустава от телят в возрасте от 1,5 до двух лет. Затем, нежный вскрыть колено теленка, сначала удалив избыток плоти, раскрытие кондилов, мениска, сухожилий и синовиальной мембраны.
Вырезать сухожилия и синовиальной мембраны позволяет сустава расчленить. Удалите мениска, чтобы разоблачить бедренную кондили. Используйте три миллиметра биопсии перфоратор, чтобы изолировать explants от нагрузки подшипник области бедренной кости и освободить их от иллюминационной поверхности путем резки скальпелем параллельно и как можно ближе к субхондральной кости, как это возможно.
Немедленно хранить и смешивать explants в DMEM F12 glutimax культуры среды, содержащей 1%пенициллин и стрептомицин в 50 миллилитров трубки или Чашки Петри. Чтобы начать культивирование тканей, перенесите экспланты в стерильную пластину 96 хорошо в ламинарном капюшоне потока размещения всех репликаций в каждой группе по диагонали, чтобы свести к минимуму изменения, вызванные испарения. Добавьте PBS к наружным колодцам пластины культуры, чтобы избежать испарения супернатанта.
Затем, мыть explants три раза в любой среде культуры или PBS. Культура explants в 200 микролитров среды культуры на колодец до начала эксперимента на срок до 10 недель в инкубаторе при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа. При применении каких-либо методов лечения, подготовить их к нужной концентрации в explant скважин путем разбавления в среде культуры до изменения среды.
Изменение культуры среды каждые два-три дня в ламинарный капюшон потока. Аккуратно удалите супернатант из каждой хорошо и перенесите его на новую пластину 96 хорошо для хранения. Немедленно добавьте 200 микролитров свежей культуры среды или лечения к каждому хорошо.
Не позволяйте explants высохнуть во время среднего изменения и убедитесь, что все explants полностью погружены в новую среду. Печать новой пластины с уплотнительной лентой и хранить его при температуре минус 20 градусов по Цельсию для биомаркера анализа текучести тканей и экспрессии белка. Чтобы начать резазурин-тест, сделайте решение среды культуры, содержащее 10%resazurin.
Урожай супернатант, как описано ранее, и погрузить explants в 10%resazurin раствор при 37 градусов по Цельсию в течение трех часов или до тех пор, пока супернатанты свою очередь, фиолетовый. Затем перенесите условный и фоновый контроль раствора резазурина на черную пластину микротитра и измерьте флуоресценцию при возбуждении 540 нанометров и выбросе 590 нанометров. После этого, погрузить explants в мытье среды в течение пяти до 10 минут, чтобы резазурин полностью рассеять и добавить новые культуры среды или лечения при использовании.
Продолжить измерение метаболической активности один раз в неделю в качестве косвенного измерения жизнеспособности клеток. В этом исследовании, бычья полная глубина explants изолированы, культурные, и лечение. Экспланты делятся на четыре группы для лечения, в том числе тех, которые лечатся онкостатином M и фактором некроза опухоли альфа, те, которые лечатся онкостатином M и фактором некроза опухоли альфа с ГМ 6001, те, которые лечатся с фактором роста инсулина один, и контроль без лечения.
Метаболическая активность относительно стабильна в течение трех недель для всех четырех групп. Существовала тенденция к увеличению IGF-1, а группы O plus T уменьшались по сравнению с контролем. O плюс T затем применяется к культуре скважин три раза в неделю, чтобы исследовать O плюс T опосредованного деградации хряща.
O плюс T, как видно, увеличение типа два коллагена деградации с седьмого дня до 21 и аггреканской деградации с 3 до 14 дней по сравнению с контрольной группой. Добавление GM 6001 в сочетании с O плюс T блокирует выпуск O плюс T опосредованного C2M, но только имеет ограниченное влияние на AGN X1 с уровнями, похожими на группу O plus T в день 10. Инсулин, как фактор роста один применяется три раза в неделю, чтобы бычьей полной глубины explants исследовать, как анаболические модули стимуляции хряща ECM оборота.
Влияние IGF-1 на экспланты хряща наблюдалось в основном на измерениях образования коллагена второй типа, как и ожидалось для анаболических стимулов. При лечении IGF-1, про-C2 уровни уменьшаются меньше, чем те, которые наблюдаются в контрольной группе, указывая, что IGF-1 стимулирует образование коллагена типа два с седьмого дня. Explants может ухудшиться с течением времени и, таким образом, тщательная пипетка имеет решающее значение во всех шагов по обработке и стирке, чтобы не потерять или уничтожить explants в различных шагах обмена средствами массовой информации.
Результаты, полученные с использованием этой модели, не должны стоять особняком, а должны подкрепляться данными, генерируемыми в тканях человека, а также в клеточных и более новых моделях для дальнейшей проверки результатов. Чтобы пролить свет на основной механизм в ткани, а не только результаты, можно дальнейшего анализа тканей и супернатантов с помощью других методов молекулярной биологии, таких как анализ экспрессии генов и белков, или иммуногистохимия, или другие постоянные методы молекулярной биологии.
