Kıkırdak implantları, kıkırdak matrisinde doku remodeling sorgulamak için bir çeviri kolay erişilebilir yöntemi temsil eder. Bu yöntem, potansiyel yeni tedavilerin eklem yapısını nasıl etkilediğine dair erken bir fikir verebilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, kıkırdağın biyobelirteçler kullanarak hücreler ve çevredeki matris arasındaki etkileşimin profilini çıkarmasağlayan doğal bir 3B ortamda kalmasıdır.
Yöntemdeki ilke kıkırdak için özel değildir. Ekseksörler yumurtalık, karaciğer ve akciğer gibi diğer dokulardan elde edilebilir ve matris kaynaklı biyobelirteçler kullanılarak sorgulanabilir. Prosedürü gösteren Amalie Engstrom, laboratuvarımızdan yüksek lisans öğrencisi olacak.
Bir aseptik ortamda bir laminar akış başlık dışında tüm doku kaynak işlemi gerçekleştirin. Yerel bir mezbaha dan, 1.5 ve iki yaş arasında buzağılardan bütün bir taze sığır tibial femoral diz eklemi elde. Sonra, nazik ilk aşırı eti kaldırarak buzağı diz incelemek, konisileler ortaya, menisküs, tendonlar, ve sinovyal membran.
Eklem parçalanmasına izin tendonu ve sinovyal membran kesin. Femoral kondiles ortaya çıkarmak için menisküs çıkarın. Femoral kondiles yük yatak alanından explants izole etmek ve mümkün olduğunca subkondral kemiğe paralel ve yakın bir neşter ile keserek auriküler yüzeyden serbest bırakmak için üç milimetrelik biyopsi zımba kullanın.
Hemen saklamak ve 50 mililitrelik tüp veya Petri çanak% 1 penisilin ve streptomisin içeren DMEM F12 glutimax kültür orta ekspertiz karıştırın. Doku culturing başlamak için, buharlaşma tarafından indüklenen varyasyonen en aza indirmek için çapraz olarak her grup içinde tüm kopyaları yerleştirerek bir laminar akış kaputunda steril bir 96 iyi plaka eksplantlar aktarın. Supernatant buharlaşmasını önlemek için kültür plakasının dış kuyularına PBS ekleyin.
Daha sonra, ya kültür orta veya PBS explants üç kez yıkayın. Kültür ekspertiz 200 mikrolitre kültür ortamı nın her kuyuda 10 hafta boyunca bir kuvözde %5 karbondioksit le 37 derece ye kadar devam eder. Herhangi bir tedavi uygularken, ortamı değiştirmeden önce kültür ortamında seyreltme ile eksplant kuyularında istenen konsantrasyona bunları hazırlayın.
Bir laminar akış başlık her iki ila üç günde bir kültür ortamı değiştirin. Supernatant'ı her kuyudan yavaşça çıkarın ve depolama için yeni bir 96 kuyu plakasına aktarın. Hemen her kuyuya 200 mikrolitre taze kültür ortamı veya tedavi ekleyin.
Eksplants orta değişim sırasında kurumasını izin vermeyin ve tüm ekstentler tamamen yeni ortamda batırılmış olduğundan emin olun. Yeni plakayı sızdırmaz bantla kapatın ve doku cirosu ve protein ekspresyonunun biyomarker analizi için eksi 20 santigrat derecede saklayın. Bir resazurin testine başlamak için% 10 resazurin içeren kültür ortamı bir çözüm yapmak.
Hasat supernatant daha önce açıklandığı gibi ve 37 derece santigrat üç saat veya supernatants mor dönüşene kadar% 10 resazurin çözeltisi eksantileri batırın. Daha sonra, siyah bir mikrotiter plaka için klimalı ve arka plan kontrol resazurin çözeltisi aktarın ve 540 nanometre ve 590 nanometre bir emisyon bir uyarma floresan ölçmek. Bundan sonra, resazurin tamamen dağıtmak ve kullanılırsa yeni kültür orta veya tedaviler eklemek için izin vermek için 5 ila 10 dakika yıkama orta explants batırın.
Hücre canlılığının dolaylı bir ölçümü olarak metabolik aktiviteyi haftada bir kez ölçmeye devam edin. Bu çalışmada, büyükbaş tam derinlik eksültarı izole edilmiş, kültürlü ve tedavi edilir. Ekspertİzler tedavi için dört gruba ayrılır, Oncostatin M ve tümör nekroz faktörü alfa ile tedavi olanlar dahil olmak üzere, Oncostatin M ve GM 6001 ile tümör nekroz faktör alfa ile tedavi olanlar, insülin büyüme faktörü bir ile tedavi olanlar, ve tedavi olmadan bir kontrol.
Metabolik aktivite dört grup için üç hafta boyunca nispeten istikrarlıdır. IGF-1'in artma eğilimi, O artı T gruplarının ise kontrole göre azalması eğilimi vardı. O artı T daha sonra o artı T aracılı kıkırdak bozulması araştırmak için kültür kuyuları haftada üç kez uygulanır.
O artı T'nin tip iki kollajen bozulmasını 7.günden 21'e, aggrecan bozulmasını ise kontrol grubuna göre 3'ten 14'e yükselttiğin görülmektedir. GM 6001'in O artı T blokları ile birlikte O artı T aracılı C2M'nin serbest bırakılması, ancak 10. Büyüme faktörü gibi insülin bir anabolik stimülasyon modülleri kıkırdak ECM ciro nasıl araştırmak için sığır tam derinlik eksültörler için haftada üç kez uygulanır.
IGF-1'in kıkırdak ekspları üzerindeki etkisi anabolik uyaranlar için beklendiği gibi tip iki kollajen oluşumu ölçümleri üzerinde gözlenmiştir. IGF-1 ile tedavi edilirken, Pro-C2 düzeyleri kontrol grubunda gözlenenlerden daha az azalır, IGF-1'in yedinci günden itibaren tip iki kollajen oluşumunu uyardığını gösterir. Ekspektörler zamanla bozulabilir ve bu nedenle farklı ortam değişim adımlarında eksültörleri kaybetmemek veya yok etmemek için tüm tedavi ve yıkama adımlarında dikkatli pipetleme çok önemlidir.
Bu model kullanılarak oluşturulan sonuçlar tek başına olmamalı, ancak bulguları daha da doğrulamak için insan dokusunun yanı sıra hücresel ve yeni modellerde üretilen verilerle desteklenmelidir. Dokuda altta yatan mekanizmaya ışık tutmak için ve sadece sonuçları değil, gen ve protein ekspresyonu analizi, immünohistokimya veya diğer kalıcı moleküler biyoloji teknikleri gibi diğer moleküler biyoloji tekniklerini kullanarak hem doku hem de süpernatants analiz etmek mümkündür.
