연골 임플란트는 연골 매트릭스에서 조직 리모델링을 심문하는 번역쉽게 접근 할 수있는 방법을 나타냅니다. 이 방법은 잠재적인 새로운 치료가 관절 구조에 미치는 영향에 대한 초기 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연골이 바이오마커를 사용하여 세포와 주변 매트릭스 사이의 상호 작용을 프로파일링을 허용하는 네이티브 3D 환경에 남아 있다는 것입니다.
이 방법의 원리는 연골에만 국한되지 않습니다. 박은 ovium, 간 및 폐와 같은 다른 조직에서 추출하고 매트릭스 유래 바이오 마커를 사용하여 심문 할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 졸업생 인 Amalie Engstrom이 될 것입니다.
무균 환경에서 라미나르 흐름 후드 외부에서 전체 조직 소싱 프로세스를 수행합니다. 현지 도살장에서 1.5세에서 2세 사이의 송아지에서 신선한 소 경골 대퇴 무릎 관절전체를 얻습니다. 그런 다음 종아리 무릎을 먼저 제거하고 condyles, 반월 상 연골, 힘줄 및 수축 막을 발견하여 종아리 무릎을 부드럽게 해부합니다.
힘줄과 끈적 끈적한 막을 잘라 관절이 절단 할 수 있도록. 대퇴추를 노출하는 반월 상 연골을 제거합니다. 3mm 생검 펀처를 사용하여 대퇴 엽물의 하중 베어링 영역에서 이출을 분리하고 가능한 한 아부콘드랄 뼈에 가깝게 메스로 절단하여 소변 표면에서 방출하십시오.
DMEM F12 글루티맥스 배양 배지에 50밀리리터 튜브 또는 페트리 접시에 1%페니실린과 연쇄절제술을 함유한 배양 배지에 즉시 저장하고 섞는다. 조직 배양을 시작하려면, 각 그룹 내에서 모든 복제를 대각선으로 배치하는 라미나르 플로우 후드에 멸균 96 웰 플레이트에 이출을 전달하여 증발에 의해 유도된 변이를 최소화한다. 초상체의 증발을 피하기 위해 배양 판의 외부 우물에 PBS를 추가합니다.
이어서, 배양 배지 또는 PBS에서 이절을 세 번 세척한다. 이산화탄소 5%를 가진 37°C의 인큐베이터에서 최대 10주 동안 실험이 시작될 때까지 양문화 배지 200마이크로리터에 배양한다. 어떤 치료를 적용하는 경우, 배지를 변경하기 전에 배양 배지에서 희석하여 유정에서 원하는 농도로 이들을 준비한다.
라미나르 플로우 후드에서 2~3일마다 배양 배지를 변경합니다. 각 우물에서 상체를 부드럽게 제거하고 저장을위한 새로운 96 웰 플레이트로 전송합니다. 즉시 신선한 배양 배지 또는 치료의 200 마이크로 리터를 각 우물에 추가합니다.
중간 변화 중에 이출가 건조하게 되지 않도록 하고 모든 이출이 새로운 매체에 완전히 침수되도록 하십시오. 새로운 플레이트를 밀봉 테이프로 밀봉하고 조직 회전율 및 단백질 발현의 바이오마커 분석을 위해 섭씨 영하 20도에 보관하십시오. 레사쥐린 테스트를 시작하려면 10%의 레사쥐린을 함유한 배양 배지의 솔루션을 만드십시오.
앞에서 설명한 대로 상체를 수확하고 3시간 동안 섭씨 37도또는 초월자가 보라색으로 변할 때까지 10%의 레사쥐린 용액에 담급니다. 이어서, 조건부 및 배경 제어 소쥐린 용액을 검은 마이크로티터 플레이트로 옮기고 540나노미터의 발산과 590나노미터의 방출에서 형광을 측정한다. 그 후, 세척 매체에 5~10분 동안 담그고 레사쥐린이 완전히 확산되고 사용시 새로운 배양 배지 또는 트리트먼트를 추가할 수 있도록 한다.
세포 생존가능성의 간접 측정으로 대사 활성을 매주 한 번 측정하십시오. 이 연구에서는 소 전체 깊이 이월이 고립되고 배양되고 치료됩니다. 박은 치료를 위한 4개의 그룹으로 나뉘며, 온코스타틴 M및 종양 괴사 인자 알파로 치료받은 사람, 온코스타틴 M 및 종양 괴사 인자 알파로 치료받은 사람, 인슐린 성장 인자 1개로 치료된 이들, 치료 없이 대조군이다.
신진 대사 활동은 4개의 단모두를 위한 3 주 내내 상대적으로 안정적입니다. IGF-1 증가 하는 경향이 있었다 및 O 플러스 T 그룹 제어에 비해 감소. O 플러스 T는 O 플러스 T 매개 연골 저하를 조사하기 위해 일주일에 세 번 문화 우물에 적용됩니다.
O 플러스 T는 대조군에 비해 7일째에서 21일째까지 2형 콜라겐 분해를 증가시키고, 아그리컨의 분해를 대조군에 비해 3일에서 14일로 증가시키는 것으로 볼 수 있다. O 플러스 T와 함께 GM 6001을 추가하면 O 플러스 T 매개 C2M의 출시를 차단하지만 10 일째에 O 플러스 T 그룹과 유사한 수준으로 AGN X1에 미치는 영향만 제한적입니다. 성장 인자 1과 같은 인슐린은 연골 ECM 회전율을 모듈하는 방법을 조사하기 위해 소 전체 깊이 각질에 매주 세 번 적용됩니다.
연골 연분에 대한 IGF-1의 효과는 주로 단백 동화 자극에 대해 예상대로 2형 콜라겐 형성의 측정에 주로 관찰되었다. IGF-1로 치료 할 때, 프로-C2 수준은 대조군에서 관찰 된 것보다 덜 감소, IGF-1 은 7 일에서 유형 2 콜라겐 형성을 자극 하는 것을 나타내는. 각출은 시간이 지남에 따라 악화될 수 있으므로 다양한 미디어 교환 단계에서 이주를 잃거나 파괴하지 않기 위해 모든 치료 및 세척 단계에서 신중한 파이펫팅이 중요합니다.
이 모델을 사용하여 생성된 결과는 단독으로 서서는 안되지만, 연구 결과를 더 검증하기 위해 인간 조직뿐만 아니라 세포 및 최신 모델에서 생성된 데이터에 의해 지원되어야 합니다. 조직의 기본 메커니즘뿐만 아니라 결과뿐만 아니라, 유전자 및 단백질 발현 분석, 또는 면역 조직 화학, 또는 기타 영구 분자 생물학 기술과 같은 다른 분자 생물학 기술을 사용하여 조직과 초월제 모두를 더 분석 할 수 있습니다.
