تمثل غرسات الغضاريف طريقة يمكن الوصول إليها بسهولة لاستجواب الأنسجة في مصفوفة الغضاريف. قد توفر هذه الطريقة نظرة مبكرة حول كيفية تأثير العلاجات الجديدة المحتملة على بنية المفاصل. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الغضروف يبقى في بيئة 3D الأصلية، والتي تسمح التنميط للتفاعل بين الخلايا والمصفوفة المحيطة باستخدام المؤشرات الحيوية.
المبدأ في طريقة ليست فريدة من نوعها للغضاريف. يمكن استخراج الاكزات من الأنسجة الأخرى مثل ovium والكبد والرئة واستجوابها باستخدام المؤشرات الحيوية المشتقة من المصفوفة. إثبات الإجراء سيكون أمالي Engstrom، طالب غراد من مختبرنا.
تنفيذ عملية المصادر الكاملة للأنسجة خارج غطاء تدفق لامين في بيئة معقمة. من المسلخ المحلي، الحصول على كامل البقرية الطازجة مفصل الركبة الفخذ من العجول بين 1.5 واثنين من العمر. ثم، تشريح لطيف الركبة ربلة الساق عن طريق إزالة أول اللحم الزائد، والكشف عن condyles، الغضروف المفصلي، الأوتار، والغشاء الزليلي.
قطع الأوتار والغشاء الزليلي مما يسمح للمشترك أن تقط. إزالة الغضروف المفصلي لفضح condyles الفخذ. استخدام خزعة ثلاثة ملليمتر اللكم لعزل explants من منطقة تحمل الحمل من condyles الفخذ والإفراج عنهم من سطح الأوريكال عن طريق قطع مع مشرط موازية لقريبة من العظام تحت المستوى ممكن.
تخزين وخلط فورا explants في DMEM F12 الغلوتيماكس الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 1٪ من البنسلين وstreptomycin في أنبوب 50 ملليلتر أو طبق بيتري. لبدء زراعة الأنسجة، نقل explants إلى لوحة 96 جيدا معقمة في غطاء تدفق المفارص وضع جميع التكرارات داخل كل مجموعة قطريا لتقليل الاختلاف الناجم عن التبخر. إضافة PBS إلى الآبار الخارجية من لوحة الثقافة لتجنب مزيد من تبخر المابير.
ثم، غسل explants ثلاث مرات في إما المتوسطة الثقافة أو برنامج تلفزيوني. ثقافة ال [إكسلّوس] في 200 ميكرولترات من ثقافة وسط لكلّ بئر حتّى البداية من التجربة ل [أوب 10] أسابيع في حاضنة في 37 درجة مئويّة مع 5٪ ثاني أكسيد كربون. إذا تطبيق أي علاجات، وإعداد هذه لتركيز المطلوبين في الآبار explant عن طريق التخفيف في الوسط الثقافة قبل تغيير المتوسطة.
تغيير الثقافة المتوسطة كل يومين إلى ثلاثة أيام في غطاء محرك تدفق لامينر. إزالة بلطف افرنح من كل بئر ونقلها إلى لوحة جديدة 96 جيدا للتخزين. على الفور إضافة 200 ميكرولترات من الثقافة الطازجة المتوسطة أو العلاج لكل بئر.
لا تدع explants تجف خلال التغيير المتوسط وضمان أن جميع explants مغمورة تماما في الوسط الجديد. ختم لوحة جديدة مع ختم الشريط وتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية لتحليل المؤشرات الحيوية لدوران الأنسجة والتعبير البروتين. لبدء اختبار resazurin، وجعل حل الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 10٪resazurin.
حصاد supernatant كما وصف سابقا وتزج explants في حل resazurin 10 ٪ في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات أو حتى يتحول الماوس الأرجواني. ثم، نقل الحل resazurin التحكم مشروط والخلفية إلى لوحة microtiter السوداء وقياس الفلوريسنس في استثارة من 540 نانومتر وانبعاث من 590 نانومتر. بعد ذلك ، غمر explants في وسط الغسيل لمدة خمس إلى 10 دقائق للسماح لل resazurin لنشر تماما وإضافة ثقافة جديدة المتوسطة أو العلاجات إذا استخدمت.
مواصلة قياس النشاط الأيضي مرة واحدة أسبوعيا كمقياس غير مباشر لقابلية الخلية. في هذه الدراسة، يتم عزل explants من الأعماق البقرية الكاملة، وزراعة، وعلاجها. وتنقسم Explants إلى أربع مجموعات للعلاج، بما في ذلك تلك التي تعامل مع Oncostatin M وعامل نخر الورم ألفا، تلك التي تعامل مع Oncostatin M وعامل نخر الورم ألفا مع جنرال موتورز 6001، تلك التي تعامل مع عامل نمو الأنسولين واحد، والسيطرة دون علاج.
النشاط الأيضي مستقر نسبيا طوال الأسابيع الثلاثة لجميع المجموعات الأربع. كان هناك ميل للمنتدى IGF-1 لزيادة و O بالإضافة إلى مجموعات T إلى الانخفاض مقارنة مع السيطرة. O بالإضافة إلى T ثم يتم تطبيقها على الآبار الثقافة ثلاث مرات في الأسبوع للتحقيق O بالإضافة إلى T بوساطة الغضروف تدهور.
O زائد T هو زيادة تدهور الكولاجين من النوع الثاني من اليوم السابع إلى 21 وتدهور aggrecan من الأيام ثلاثة إلى 14 بالمقارنة مع مجموعة التحكم. إضافة جنرال موتورز 6001 في تركيبة مع O بالإضافة إلى T كتل الإفراج عن O زائد T بوساطة C2M, ولكن فقط تأثير محدود على AGN X1 مع مستويات مماثلة لمجموعة O زائد T في اليوم 10. الأنسولين مثل عامل النمو واحد يتم تطبيق ثلاث مرات أسبوعيا لاكزات عمق كامل البقر للتحقيق في كيفية وحدات التحفيز الابتنائية دوران ECM الغضروف.
وقد لوحظ تأثير IGF-1 على explants الغضروف أساسا على قياسات نوع اثنين تشكيل الكولاجين كما هو متوقع للمنبهات الابتنائية. عند التعامل مع IGF-1، تنخفض مستويات الموالية C2 أقل من تلك التي لوحظت في مجموعة التحكم، مما يشير إلى أن IGF-1 يحفز تشكيل الكولاجين من النوع الثاني من اليوم السابع. قد تتدهور Explants مع مرور الوقت ، وبالتالي الأنابيب حذرا أمر بالغ الأهمية في جميع خطوات العلاج والغسيل من أجل عدم فقدان أو تدمير explants في مختلف وسائل الإعلام تبادل الخطوات.
وينبغي ألا تكون النتائج الناتجة عن استخدام هذا النموذج قائمة بذاتها، بل ينبغي أن تكون مدعومة بالبيانات المتولدة في الأنسجة البشرية وكذلك الخلوية وفي النماذج الأحدث للتحقق من صحة النتائج. لتسليط الضوء على الآلية الكامنة في الأنسجة وليس فقط النتائج، فمن الممكن مواصلة تحليل كل من الأنسجة والمابات باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية الأخرى، مثل تحليل الجينات والتعبيرات البروتينية، أو الكيمياء المناعية، أو غيرها من تقنيات البيولوجيا الجزيئية الدائمة.
