שתלי סחוס מייצגים שיטה תרגום נגיש בקלות לחקור שיפוץ רקמות במטריצת הסחוס. השיטה עשויה לספק תובנה מוקדמת כיצד טיפולים חדשים פוטנציאליים משפיעים על מבנה המפרקים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהסחוס נשאר בסביבה תלת-מימדית מקורית, המאפשרת יצירת פרופיל של האינטראקציה בין התאים לבין המטריצה שמסביב באמצעות סמנים ביולוגיים.
העיקרון בשיטה אינו ייחודי לסחוס. Explants ניתן לחלץ מרקמות אחרות כגון אוביום, כבד, ריאות ונחקר באמצעות סמנים ביולוגיים מטריצה נגזר. הפגנת ההליך תהיה אמלי אנגסטרום, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו.
בצע את כל תהליך המקור של הרקמות מחוץ למכסה המנוע של זרימה למינארית בסביבה אספטית. מבית מטבחיים מקומי, השג מפרק ברך טיביאלי טרי שלם מעגלים בגילאי שנה וחצי עד שנתיים. לאחר מכן, בעדינות לנתח את הברך עגל על ידי הסרת תחילה את הבשר העודף, חשיפת condyles, מניסקוס, גידים, קרום סינוביאלי.
חותכים את הגידים ואת קרום סינוביאלי המאפשר המפרק לבתר. הסר את המניסקוס כדי לחשוף את תריס הירך. השתמש אגרוף ביופסיה שלושה מילימטר כדי לבודד explants מאזור נושאת העומס של תבלין הירך ולשחרר אותם מפני השטח auricular על ידי חיתוך עם אזמל מקביל וקרוב ככל האפשר לעצם subchondral ככל האפשר.
מיד לאחסן ולערבב את explants ב DMEM F12 גלוטימקס תרבות בינוני המכיל 1% פניצילין סטרפטומיצין בצינור 50 מיליליטר או צלחת פטרי. כדי להתחיל culturing רקמות, להעביר את explants לצלחת סטרילית 96 גם במכסה המנוע זרימה למינארית הצבת כל שכפולים בתוך כל קבוצה באלכסון כדי למזער את הווריאציה הנגרמת על ידי אידוי. הוסף PBS ל בארות החיצוניות של צלחת התרבות כדי למנוע עוד יותר אידוי של העל-טבעי.
לאחר מכן, לשטוף את explants שלוש פעמים או בינוני תרבות או PBS. תרבות explants ב 200 microliters של תרבות בינונית לגם עד תחילת הניסוי עד 10 שבועות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. אם מיישמים טיפולים כלשהם, מכינים אותם לריכוז המבוקש בארות explant על ידי דילול במדיום התרבות לפני שינוי המדיום.
שנה את מדיום התרבות כל יומיים עד שלושה במכסה המנוע של זרימה למינארית. מוציאים בעדינות את העל-טבעי מכל באר ומעבירים אותו לצלחת חדשה של 96 בארות לאחסון. מיד להוסיף 200 microliters של תרבות טרייה בינוני או טיפול לכל באר.
אל תתנו ל explants להתייבש במהלך השינוי הבינוני ולהבטיח כי כל explants שקועים לחלוטין במדיום החדש. לאטום את הצלחת החדשה עם סרט איטום ולאחסן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס לניתוח סמן ביולוגי של תחלופת רקמות וביטוי חלבון. כדי להתחיל במבחן resazurin, לעשות פתרון של מדיום תרבות המכיל 10%resazurin.
לקצור את העל-טבעי כפי שתואר קודם לכן ולטבול את המתפוצצים בתסיסה של 10%resazurin ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות או עד העל-טבעיים הופכים סגולים. לאחר מכן, להעביר את הפתרון resazurin בקרת רקע מותנה לצלחת microtiter שחור למדוד את הפלואורסצנטיות בגירוש של 540 ננומטר פליטה של 590 ננומטר. לאחר מכן, להטביע את explants במדיום לשטוף במשך חמש עד 10 דקות כדי לאפשר resazurin להתפזר לחלוטין ולהוסיף מדיום תרבות חדש או טיפולים אם נעשה שימוש.
המשך למדוד את הפעילות המטבולית פעם בשבוע כמדידה עקיפה של כדאיות התא. במחקר זה, מפזרי עומק מלאים של חזיר מבודדים, מתורבתים ומטופלים. Explants מחולקים לארבע קבוצות לטיפול, כולל אלה שטופלו ב- Oncostatin M וגורם נמק הגידול אלפא, אלה שטופלו ב- Oncostatin M וגורם נמק הגידול אלפא עם GM 6001, אלה שטופלו בגורם הגדילה לאינסולין אחד, ובקרה ללא טיפול.
הפעילות המטבולית יציבה יחסית לאורך שלושת השבועות עבור כל ארבע הקבוצות. הייתה נטייה IGF-1 להגדיל O בתוספת קבוצות T לרדת בהשוואה לשליטה. O פלוס T מוחל אז על בארות תרבות שלוש פעמים בשבוע כדי לחקור O בתוספת T תיווך השפלה סחוס.
O פלוס T נראה להגדיל את סוג שני השפלה קולגן מהיום השביעי עד 21 השפלה aggrecan מיום שלוש עד 14 בהשוואה לקבוצת הביקורת. הוספת GM 6001 בשילוב עם O פלוס T חוסמת את שחרורו של ה-O פלוס T מתווך C2M, אבל יש רק השפעה מוגבלת על AGN X1 עם רמות דומות O בתוספת T הקבוצה ביום 10. אינסולין כמו פקטורי גדילה אחד מוחל שלוש פעמים בשבוע כדי לפזר עומק מלא בקר כדי לחקור כיצד מודולים גירוי אנבוליים תחלופת ECM הסחוס.
ההשפעה של IGF-1 על explants הסחוס נצפתה בעיקר על מדידות של סוג שני היווצרות קולגן כצפוי עבור גירויים אנבוליים. כאשר מטפלים עם IGF-1, רמות pro-C2 להקטין פחות מאלה שנצפו בקבוצת הביקורת, המציין כי IGF-1 מגרה סוג שני היווצרות קולגן מהיום השביעי. Explants עלול להתדרדר לאורך זמן ובכך צינור זהיר הוא קריטי בכל צעדי טיפול וכביסה על מנת לא לאבד או להרוס explants בשלבי חילופי התקשורת השונים.
תוצאות שנוצרו באמצעות מודל זה לא צריך לעמוד לבד, אבל להיות נתמך על ידי נתונים שנוצרו רקמה אנושית, כמו גם הסלולר במודלים חדשים יותר כדי לאמת עוד יותר את הממצאים. כדי לשפוך אור על המנגנון הבסיסי ברקמה ולא רק על התוצאות, ניתן להמשיך לנתח הן רקמות והן על-טבעיים באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית אחרות, כגון ניתוח ביטוי גנים וחלבונים, או אימונוהיסטוכימיה, או טכניקות ביולוגיה מולקולרית קבועות אחרות.
