Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist die Erzeugung eines infektiösen rekombinanten Zika-Virus aus einem cDNA-Klon in voller Länge, der in einem bakteriellen künstlichen Chromosom unter der Kontrolle des menschlichen Zytomegalievirus sofort-früh prognostmontiert wird. Die Entwicklung eines umgekehrten genetischen Systems für RNA-Viren wie das Zika-Virus ermöglicht die direkte Manipulation des Virusgenoms, um mehrere Aspekte der Virusbiologie und Pathogenese zu untersuchen und eine Impfstoffstrategie zu entwickeln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Konstruktion des infektiösen Klons des Zika-Virus als bakterielles künstliches Chromosom die mit dem Flavivirus-Genom verbundene Toxizität überwindet und die Rettung von infektiösen Viren durch direkte Transfektion des BAC-cDNA-Klons in anfällige Zellen ermöglicht.
Diese Methode könnte auf die Konstruktion stabiler und voll funktionsfähiger infektiöser cDNA-Klone für andere Flaviviren sowie andere positiv gestrandete RNA-Viren angewendet werden. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, erstellen Sie den Zika-Virus-cDNA-Klon, wie im Textprotokoll beschrieben, unter Verwendung geeigneter Einschränkungssites. Vier DNA-Fragmente, die das Genom des Zika-Virus überspannen, die vom menschlichen CMV-Promotor am Fünf-Prim-Ende flankiert werden, und das Hepatitis-Delta-Virus Ribososo und das Rinderwachstumshormon-Ende und Polyadenylierungssequenzen am Drei-Prim-Ende werden in einem bakteriellen künstlichen Chromosomenplasmid zusammengesetzt.
Zuerst wachsen sie eine einzige Kolonie von E.coli DH10B, die den pBAC-Zika-Virus infektiösen Klon in fünf MilliliterLB-Medium mit Chloramphenicol für acht Stunden bei 37 Grad Celsius mit sanftem Schütteln trägt. Dann 500 Milliliter des LB-Mediums, das Chloramphenicol enthält, in einen Zweiliterkolben geben. Fügen Sie einen Milliliter der vorbereiteten Bakterienkultur in den Kolben und wachsen die Zellen bei 37 Grad Celsius für 14 bis 16 Stunden, bis die OD600 etwa 0,6 bis 0,8 beträgt.
Danach verwenden Sie ein kommerzielles Kit speziell für BAC-Reinigung entwickelt, um die BAC-Infektion cDNA Klon durch alkalische Lyse zu reinigen, indem Sie die Anweisungen des Herstellers. Einen Tag vor der Transfektion platten Vero-Zellen in die Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte mit einer Dichte von 500.000 Zellen pro Brunnen im Wachstumsmedium. Um den Transfektionsmix vorzubereiten, fügen Sie vier Mikrogramm des BAC cDNA-Klons zu 250 Mikroliter Serum reduzierten Medium sund und sorgfältig mischen.
In einem separaten Rohr 12 Mikroliter Transfektionsmittel in 250 Mikroliter Serum reduziert Medium verdünnen. Wirbel bei Raumtemperatur für fünf Minuten mischen und inkubieren. Als nächstes kombinieren Sie die verdünnte BAC cDNA mit dem Transfektionsmittel.
Sorgfältig mischen und bei Raumtemperatur 20 bis 30 Minuten inkubieren. Während dieser Inkubationszeit verwenden Sie Wachstumsmedium ohne Antibiotika, um die Vero-Zellen zu waschen und die Zellen in einem Milliliter frisches Medium ohne Antibiotika zu lassen. Dann verteilen Sie die 500 Mikroliter der cDNA und Transfektionreagenz-Mischung auf die Vero-Zellen tropfenweise.
Die Platte hin und her schaukeln, um die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für sechs Stunden zu mischen und zu bebrüten. Danach entfernen Sie das Transfektionsmedium und fügen Sie zwei Milliliter frisches Wachstumsmedium mit Antibiotika hinzu. Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid, wobei sichergestellt ist, dass sie jeden Tag auf Induktion der zytopathischen Wirkung überprüfen.
Nach vier bis sechs Tagen Transfektion, wenn die CPE ist etwa 50 bis 75%sammeln die Gewebekultur Überstände in 15-Milliliter konischen Röhren und Zentrifuge für 10 Minuten Zellabfall zu entfernen. Dann ernten Sie die Überstande, die das rekombinante Zika-Virus enthalten, und entsorgen Sie die Zellpellets. Aliquot den Überstand in Kryoröhren und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.
Zunächst können Vero-Zellen zu 90 % zusammengezüchtet werden. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und infizieren Sie sie mit dem geretteten Virus mit der Vielzahl der Infektion von 0,1 in Wachstumsmedium mit 2%FBS. Legen Sie die Platten der Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und Gestein alle 15 Minuten für die 90-minütige Adsorptionszeit.
Nach viraler Adsorption, entfernen Sie das virale Inokulum und fügen Sie frisches Wachstumsmedium mit 2%FBS. Drei oder vier Tage zu den zuvor verwendeten Bedingungen inkubieren. Wenn die CPE ist etwa 75%sammeln die Gewebekultur Überstand und Zentrifuge, um Zellablagerungen zu entfernen.
Dann ernten Sie den Überstand, der das rekombinante Zika-Virus enthält, und entsorgen Sie das Pellet. Aliquot der Überstand in Kryoröhren. Die Rohre in eine Gefrierbox geben und bei minus 80 Grad Celsius aufbewahren.
Wenn Sie bereit sind, entfernen Sie ein Virus aliquot aus dem Gefrierschrank und bestimmen Sie den viralen Titer durch Plaque-Assay, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Studie wird ein stabiler, vollständiger cDNA-Klon des Zika-Virusstamms Rio Grande do Norte Natal erzeugt, indem vier überlappende cDNA-Fragmente sequenziell in das bakterielle künstliche Chromosom pBeloBAC11 mit herkömmlichen Klonmethoden und einzigartigen Restriktionsstellen im viralen Genom klonen. Dieser cDNA-Klon in voller Länge wurde am Fünf-Prim-Ende vom humanen Zytomegalievirus-Promotor flankiert, um die Expression viraler RNA im Zellkern transfizierter Zellen und am Drei-Primat-Ende durch das Hepatitis-Delta-Virus Ribosom gefolgt von der Rinderwachstumshormon-Beendigung und Polyadenylierungssequenz zu ermöglichen, um RNAs zu erzeugen, die das exakte Drei-Prim-Ende des viralen Genoms enthalten.
Sobald die BAC cDNA montiert ist, kann das infektiöse Virus nach der direkten Transfektion von anfälligen Vero-Zellen mit dem BAC-cDNA-Klon mit kationischen Liposomen leicht zurückgewonnen werden. Mit diesem Ansatz kann das R-Zika-Virus RGN mit Tittern von mehr als einer Million Plaquebildenden Einheiten pro Milliliter gerettet werden. Darüber hinaus induziert das gerettete Virus eine klare zytopathische Wirkung und erzeugt homogene Plaques von etwa zwei Millimetern Größe.
Die gerettete Virusidentität wird durch Immunfluoreszenzanalyse mit einem spezifischen monoklonalen Antikörper für das Zika-Virus-E-Protein bestätigt. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass das infektiöse rekombinante Zika-Virus aus in einem BAC zusammengesetzten cDNA-Klonen in voller Länge gerettet werden kann. Zusammenfassend haben wir einen leistungsstarken genetischen Ansatz des Zika-Virus entwickelt, der auf der Verwendung eines bakteriellen künstlichen Chromosoms basiert, das angepasst werden könnte, um die stabilen und funktionellen Infektionen mit dem cDNA-Klon anderer positiv-strangRNA-Viren zu erzeugen, um die Untersuchung der Pathologie zu erleichtern, einen Impfstoff zu entwickeln und die Identifizierung von Medikamenten mit antiviraler Aktivität zu erleichtern.
