Systemweite Studien sind entscheidend für das tiefe Verständnis der biologischen Funktionen. Für verschiedene omics-Plattformen sind jedoch mehrere unabhängige Stichproben erforderlich, was eine hohe Variabilität der Daten einführt. Diese Methode bietet eine robuste und hochdurchsatzstarke Strategie für die gleichzeitige Extraktion von Chlorophyll, Lipiden, Metaboliten, Proteinen und Stärke aus einer einzigen Probe des Modells grüne Alge, Chlamydomonas reinhardtii.
Für die Chlorophyll-, Lipid- und Metabolitenextraktion, ordnen Sie die Tuben der geernteten Chlamydomonas-Zellpellets in flüssigem Stickstoff an. Setzen Sie das Pellet in jedem Rohr mit einem Milliliter 20-Grad-Extraktionspuffer ein. Um eine Verdunstung des Extraktionspuffers mit niedriger Viskosität zu vermeiden, wirbeln die Rohre schnell so lange aus, bis die Zellen innerhalb des Extraktionsgemisches gut homogenisiert sind und die Lösung in zwei Milliliter-Mikrozentrifugenrohre auswerten.
Sonicate die Kulturen in einem Beschallungsbad in eiskaltem Wasser für 10 Minuten vor der Inkubation auf einem Orbital-Shaker bei 1.000 Umdrehungen pro Minute für 60 Minuten bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation 650 Mikroliter Extraktionspuffer zwei hinzufügen und die Proben vor der Zentrifugation kurz wirbeln. Um die Fraktionen zu aliquotieren, übertragen Sie 500 Mikroliter der oberen MTBE-Lipidphase in ein beschriftetes 1,5-Milliliter-Rohr.
Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um die Lipidphase zu entfernen und 650 Mikroliter der unteren polaren und semipolaren Metabolitenphase in neue beschriftete Röhren zu übertragen. Saugen Sie das überschüssige Volumen, um die verbleibende untere Phase zu entfernen und frieren Sie die festen Pellets in flüssigem Stickstoff für 80 Grad Lagerung ein. Zur Bestimmung des polaren Metaboliten das getrocknete Pellet der Polarphase in Methoxyaminhydrochlorid-Pyridin-Lösung zur Methoxymisierung der Carbonylgruppen wieder aufheben und die Proben 90 Minuten lang bei 30 Grad Celsius erhitzen.
Am Ende der Inkubation die Proben mit n-Methyl-n-Trifluoracetamid 30 Minuten bei 37 Grad Celsius nach Standardprotokollen ableiten. Verwenden Sie die Gaschromatographie gekoppelt mit der Zeit-of-Flight-Massenspektrometrie, um die primären Metaboliten zu analysieren. Zur bestimmungsgemäßen bestimmungsgemäßen unpolaren Metaboliten das getrocknete Pellet der unpolaren Phase in einer Mischung aus sieben bis drei Volumen zu Volumen Acetonitril zu Isopropanol aussetzen und die Pellets durch Zentrifugation sedimentieren.
Trennen Sie dann die Proben auf einer Reverse-Phase-C8-Säule auf einem ultraleistungsfähigen Flüssigchromatographiesystem. Zur Bestimmung des Chlorophyllgehalts 100 Mikroliter der MTBE-Phase mit 900 Mikrolitern 90%Methanol für Methodenrohling sowie die Versuchsproben mischen. Messen Sie dann die Absorption auf einem Spektralphotometer bei 655 und 652 Nanometer Wellenlängen, um zwischen Chlorophyll a und Chlorophyll b zu unterscheiden und den Chlorophyll-A- und b-Gehalt und den gesamten Chlorophyllgehalt zu berechnen.
Für die Proteinextraktion das untere Phasenpellet in 200 Mikroliter Proteinpuffer auflösen und die Probe 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie am Ende der Inkubation die Probe und übertragen Sie den proteinhaltigen Überstand in ein neues Röhrchen. Messen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay.
Um das Protein zu verdauen, reduzieren Sie 15 Mikrogramm der Probe in fünf Millimolar Dithiothreitol für 30 Minuten, gefolgt von Alkylierung mit 10 Millimolar Iodoacetamid für 30 Minuten bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. Am Ende der Alkylielung Trypsin/Lys-C-Lösung mit einem Proteinverhältnis von 25 zu einem Protein mischen und die Probe drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Verdünnen Sie die Probe sechsfach in 50 Millimolaren Tris Hcl für eine nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius.
Am nächsten Morgen die Verdauung mit Trifluoressigsäure auf eine Endkonzentration von 0,5 bis 1% beenden Nach der Verdauung, konzentrieren Sie die Proben auf nahezu Trockenheit, so dass zwei bis fünf Mikroliter Lösung in einem Vakuumkonzentrator ohne Erhitzung. Setzen Sie die Probe im Ladepuffer wieder aus. Analysieren Sie die Peptidmischungen mittels flüssiger Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie mit einem hochauflösenden Massenspektrometer, das mit einem Nano-Ultradruckflüssigkeitschromatographiesystem verbunden ist.
Um die Peptide zu trennen, laden Sie vier Mikroliter Probe auf eine 20 Zentimeter reverse phase geladene Oberflächenhybridsäule mit einem Innendurchmesser von 75 Mikrometern und einer Partikelgröße von 1,7 Mikrometern. Verwenden Sie partielle Offline-Einstellungen mit einem isokratischen Gradienten, der auf 3 % des Puffers B festgelegt ist und 14 Minuten lang gehalten wird, bevor die Schleife mit der Spalte in die Online-Position verschoben wird, danach wird der Gradient linear für 50 Minuten erhöht, bis 20% Puffer B erreicht ist. Eine Verschiebung des Zellvolumens kann beobachtet werden, wenn die Zellen während der Lichtphase in der Größe wachsen, gefolgt von der Freisetzung von Tochterzellen ab dem Ende der Lichtphase von 10 Stunden.
Sobald alle Tochterzellen freigegeben sind, kann eine Verschiebung des Zellvolumens beobachtet werden, da die neu freigesetzten Tochterzellen bereit sind, den nächsten Zyklus zu beginnen. Basierend auf der Gaschromatographie-Massenspektrometrieanalyse der Polarfraktion wurden in diesem repräsentativen Experiment 65 Metaboliten kommentiert. Die Flüssigchromatographie-Massenspektrometrieanalyse der lipidhaltigen neutralen Phase führte zur Identifizierung von 204 verschiedenen Lipidarten, die verschiedene Lipidklassen abdeckten.
Die Hauptkomponentenanalyse kann verwendet werden, um globale Verschiebungen in den Metaboliten und Lipiden über den Zellzyklus hinweg mit einer Trennung von hellen und dunklen Phasen sowie semizyklischen Phasen zu visualisieren, die sowohl für metabolome noch für lipidomische Daten beobachtet wurden. Hier wird ein Überblick über die funktionelle Anreicherung von 2. 463 identifizierten angereicherten Proteinen gezeigt. Das verbleibende Pellet nach der Proteinextraktion kann zur reproduzierbaren Quantifizierung der Stärke verwendet werden, wie die geringe Standardabweichung zwischen verschiedenen Replikationen zeigt.
Es ist wichtig, das Trocknen der oberen organischen Chlorophyllphase zu vermeiden, da dies den Chlorophyllgehalt im Lösungsmittel beeinflussen und den Normalisierungsfaktor für die Proben beeinflussen kann. Für die biochemische Charakterisierung der extrahierten Molekülarten können verschiedene analytische Verfahren implementiert werden.
