시스템 전반의 연구는 생물학적 기능에 대한 심층적인 이해를 위해 매우 중요합니다. 그러나 다양한 omics 플랫폼에는 여러 개의 독립적인 샘플이 필요하며 데이터에 높은 양의 가변성을 도입합니다. 이 방법은 모델 녹색 조류, 클라미도모나스 라인하르트티의 단일 샘플에서 엽록소, 지질, 대사 산물, 단백질 및 전분의 동시 추출을 위한 견고하고 높은 처리량 전략을 제공합니다.
엽록소, 지질 및 대사 산물 추출의 경우 수확된 클라미도모나스 세포 펠릿의 튜브를 액체 질소에 배치합니다. 각 튜브의 펠릿을 20도 추출 버퍼 1밀리리터로 재차 놓습니다. 낮은 점도 추출 버퍼의 증발을 피하기 위해, 세포가 추출 혼합물 내에서 균질화 될 때까지 튜브를 신속하게 소용돌이시키고 용액을 두 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 알리쿼트합니다.
10분 동안 1, 000회전의 궤도 셰이커에서 10분 동안 얼음 차가운 물에 있는 초음파 욕조에서 문화를 초음파 처리하여 섭씨 4도에서 60분 동안 분당 000회전합니다. 인큐베이션이 끝나면 650마이크로리터의 추출 버퍼 2를 추가하고 원심분리 전에 시료를 잠시 소용돌이시다. 분획을 알리인용하려면 상부 MTBE 지질 단계의 500 마이크로리터를 라벨이 부착된 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오.
200 마이크로리터 파이펫을 사용하여 지질 상을 제거하고 낮은 극지 및 반극성 대사 산물 단계의 650 마이크로리터를 새로운 표지된 튜브로 옮춥시다. 남은 하위를 제거하고 80도 저장을 위해 액체 질소에 고체 펠릿을 동결시키기 위해 초과 부피를 흡인한다. 극성 대사 산물 결정의 경우, 카보닐 군의 메톡시미화를 위한 메톡사민 염산염 피리딘 용액에서 극지상의 말린 펠릿을 재중단하고 90분 동안 30°C에서 시료를 가열한다.
인큐베이션의 끝에서, 표준 프로토콜에 따라 섭씨 37도에서 30 분 동안 n-메틸-n-trifluoracetamide로 샘플을 파생시. 가스 크로마토그래피를 비행 시간 질량 분석법에 결합하여 1차 대사산물을 분석합니다. 비극성 대사 산물 결정의 경우, 원심분리에 의한 펠릿을 원심분리량에 의해 펠릿에 부피 아세토닐릴에 7~3부량의 혼합물로 비극성 상의 말린 펠릿을 재연한다.
그런 다음 초고성능 액체 크로마토그래피 시스템에서 역상 C8 컬럼의 샘플을 분리합니다. 엽록소 함량 측정을 위해 MTBE 상의 마이크로리터 100개와 900마이크로리터900 마이크로리터를 90%의 메탄올과 혼합하여 블랭크 방법과 실험용 시료를 사용한다. 그런 다음 655 및 652 나노미터 파장에서 흡광도계를 측정하여 엽록소 와 엽록소 b를 구별하고 엽록소 a 및 b 함량 및 총 엽록소 함량을 계산합니다.
단백질 추출을 위해, 단백질 완충제의 200 마이크로 리터에 하부 펠릿을 용해하고 30 분 동안 실온에서 샘플을 배양. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리시 시료를 원심분리하고 단백질 함유 상체를 새로운 튜브로 전달한다. 브래드포드 분석서를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
단백질을 소화하기 위해, 5 밀리머 디티오스레이톨에서 샘플 15 마이크로그램을 30분 간 줄이고, 실온에서 30분 동안 10밀리알라 요오도아세타미드를 흡입하여 빛으로부터 보호합니다. 알킬레이션의 끝에서 트립신/Lys-C 용액을 25 대 1의 단백질로 혼합하여 비율을 프로테아제하고 37°C에서 3시간 동안 시료를 배양합니다. 샘플을 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 50 밀리몰러 트라이 Hcl에서 6배 희석합니다.
다음날 아침, 소화 후 0.5~1%의 최종 농도로 삼불화산으로 소화를 종료하고, 시료를 건조에 가깝게 농축하여 가열 없이 진공 농축기에 2~5마이크로리터를 남깁니다. 로딩 버퍼에서 샘플을 다시 일시 중지합니다. 나노 초압 액체 크로마토그래피 시스템에 연결된 고해상도 질량 분광계를 사용하여 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법에 의해 펩티드 혼합물을 분석한다.
펩티드를 분리하려면 4개의 마이크로리터의 시료를 20센티미터 역위상 하전 표면 하이브리드 컬럼에 적재하고 내지름 75마이크로미터와 입자 크기는 1.7마이크로미터이다. 루프가 열과 함께 온라인 위치로 이동하기 전에 14분 동안 유지되는 버퍼 B의 3%로 설정된 등방성 그라데이션으로 부분 루프 오프라인 설정을 사용하여 20%버퍼 B에 도달할 때까지 그라데이션이 50분 동안 선형으로 증가합니다. 세포부피의 변화는 세포가 광상 전반에 걸쳐 크기가 커짐에 따라 관찰될 수 있으며, 그 다음에는 10시간으로부터 광상 끝에서 시작되는 딸 세포의 방출이 뒤따릅니다.
일단 모든 딸 세포가 풀어 놓이면, 새로 방출된 딸 세포가 다음 주기를 시작하기 위하여 처분되기 때문에 세포 부피의 교대를 관찰할 수 있습니다. 극지 분획의 가스 크로마토그래피 질량 분광분석 분석에 기초하여, 이 대표적인 실험에서는 65개의 대사산물이 주석을 지었다. 지질 함유 중성 상에 대한 액체 크로마토그래피 질량 분석은 다양한 지질 클래스를 포함하는 204개의 뚜렷한 지질 종의 식별으로 이어졌다.
주요 성분 분석은 세포 주기 전반에 걸쳐 대사 산물과 지질의 글로벌 변화를 시각화하는 데 사용할 수 있으며, 암타볼로믹스와 지질 데이터 모두에 대해 관찰된 반순환 상뿐만 아니라 빛과 어두운 위상을 분리한다. 여기서, 2, 463의 기능적 농축에 대한 개요가 증원된 단백질을 나타내고 있다. 단백질 추출 후 나머지 펠릿은 다양한 복제 중 낮은 표준 편차에 의해 표시된 전분의 재현 가능한 정량화에 사용될 수 있다.
상부 엽록소 유기 상의 건조를 피하는 것이 중요합니다, 이것은 용매에 있는 엽록소의 수준에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 견본에 대한 정규화 인자에 영향을 미칩니다. 추출된 분자 종의 생화학적 특성화를 위해 다양한 분석 적 절차를 구현할 수 있다.
