Estudos em todo o sistema são cruciais para a compreensão aprofundada das funções biológicas. No entanto, várias amostras independentes são necessárias para diferentes plataformas de omics, introduzindo alta quantidade de variabilidade aos dados. Este método oferece uma estratégia robusta e de alta produtividade para extração simultânea de clorofila, lipídios, metabólitos, proteínas e amido de uma única amostra do modelo de algas verdes, Chlamydomonas reinhardtii.
Para extração de clorofila, lipídio e metabólito, organize os tubos de pelotas de células chlamydomonas colhidas em nitrogênio líquido. Resuspend a pelota em cada tubo com um mililitro de tampão de extração de 20 graus. Para evitar a evaporação do tampão de extração de baixa viscosidade, rapidamente vórtice dos tubos até que as células estejam bem homogeneizadas dentro da mistura de extração e aliquot a solução em dois tubos de microcentrifuuge mililitro.
Sonicar as culturas em um banho de sônica em água gelada por 10 minutos antes da incubação em um agitador orbital a 1.000 rotações por minuto durante 60 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, adicione 650 microliters de tampão de extração dois e brevemente vórtice das amostras antes da centrifugação. Para alíquotar das frações, transfira 500 microliters da fase lipídica mtbe superior para um tubo de 1,5 mililitro rotulado.
Use uma pipeta de 200 microliteres para remover a fase lipídica e transferir 650 microliters da fase metabólito polar e semipolar inferior para novos tubos rotulados. Aspire o volume excedente para remover a fase inferior restante e congelar as pelotas sólidas em nitrogênio líquido para armazenamento de 80 graus. Para determinação do metabólito polar, ressuspenque a pelota seca da fase polar na solução de piridina de hidrocloreto de metoxia para metoximização dos grupos carboniso e aqueça as amostras a 30 graus Celsius por 90 minutos.
Ao final da incubação, derivatize as amostras com n-metil-n-trifluoracetamida por 30 minutos a 37 graus Celsius de acordo com os protocolos padrão. Use cromatografia gasosa acoplado à espectrometria de massa do tempo de voo para analisar os metabólitos primários. Para determinação metabólito nãopolar, resuspenque a pelota seca da fase nãopolar em uma mistura de sete a três volumes de acetonitrilo de volume para isopropanol e sedimente as pelotas por centrifugação.
Em seguida, separe as amostras em uma coluna C8 de fase inversa em um sistema de cromatografia líquida de ultra-desempenho. Para determinação do teor de clorofila, misture 100 microlitadores da fase MTBE com 900 microliters de 90% de metanol para método em branco, bem como as amostras experimentais. Em seguida, meça a absorvância em um espectrofotômetro em 655 e 652 comprimentos de onda de 655 e 652 nanômetros para distinguir entre clorofila a e clorofila b e calcular o teor de clorofila a e b e o teor total de clorofila.
Para extração de proteínas, dissolva a pelota de fase inferior em 200 microliters de tampão proteico e incubar a amostra à temperatura ambiente por 30 minutos. No final da incubação, centrifugar a amostra e transferir o supernanato contendo proteínas para um novo tubo. Meça a concentração de proteínas usando o ensaio de Bradford.
Para digerir a proteína, reduza 15 microgramas da amostra em cinco dithiothiothreitol milimôlar por 30 minutos, seguido de alquilação com iodoacetamida milimiliar por 30 minutos à temperatura ambiente, protegido da luz. No final da alquilação, misture a solução Trypsin/Lys-C a uma proporção de 25 a uma proteína para protease e incubar a amostra por três horas a 37 graus Celsius. Diluir a amostra seis vezes em 50 tris mililitros Hcl para uma incubação durante a noite a 37 graus Celsius.
Na manhã seguinte, termine a digestão com ácido trifluoroacético a uma concentração final de 0,5 a 1%Após a digestão, concentre as amostras para quase secura, deixando de dois a cinco microlitradores de solução em um concentrador de vácuo sem aquecimento. Resuspenda a amostra no buffer de carregamento. Analise as misturas de peptídeos por espectrometria de massa cromatografia líquida usando um espectrômetro de massa de alta resolução conectado a um sistema de cromatografia líquida de nano ultra pressão.
Para separar os peptídeos, carregue quatro microliters de amostra em uma coluna híbrida de superfície de 20 centímetros de fase reversa carregada com diâmetro interno de 75 micrômetros e tamanho de partícula de 1,7 micrômetros. Use configurações offline de loop parcial com um gradiente isocrático definido em 3% do buffer B, mantido por 14 minutos antes que o loop seja deslocado para a posição on-line com a coluna, após o qual o gradiente será aumentado linearmente por 50 minutos até que 20% do buffer B seja atingido. Uma mudança no volume celular pode ser observada à medida que as células crescem em tamanho durante toda a fase de luz, seguida pela liberação de células filhas a partir do final da fase de luz a partir de 10 horas.
Uma vez que todas as células filhas tenham sido liberadas, uma mudança no volume celular pode ser observada, à medida que as células filhas recém-liberadas são dispostas a começar o próximo ciclo. Com base na análise de espectrometria de massa da cromatografia gasosa da fração polar, neste experimento representativo, 65 metabólitos foram anotados. A análise da espectrometria de massa cromatografia líquida da fase neutra contendo lipídios levou à identificação de 204 espécies lipídicas distintas que cobriam várias classes lipídicas.
A análise dos componentes principais pode ser usada para visualizar mudanças globais nos metabólitos e lipídios ao longo do ciclo celular com uma separação de fases claras e escuras, bem como fases semicíclicas observadas tanto para dados metabólicos quanto lipidômicos. Aqui, mostra-se uma visão geral do enriquecimento funcional de 2.463 proteínas enriquecidas identificadas. A pelota restante após a extração de proteínas pode ser usada para quantificação reprodutível do amido, como indicado pelo baixo desvio padrão entre várias réplicas.
É importante evitar a secagem da fase orgânica da clorofila superior, pois isso pode influenciar os níveis de clorofila no solvente, afetando o fator de normalização das amostras. Vários procedimentos analíticos podem ser implementados para a caracterização bioquímica das espécies moleculares extraídas.
