Diese Arbeit wurde durch eine Wellcome Trust Senior Fellowship ausgezeichnet zu Ian Goodfellow, und ein Marie Curie Intra European Fellowship (RP7 European Research Council) ausgezeichnet zu Armando Arias finanziert. Wir möchten Io Hong Cheong, Dr. Rebecca Robey und Dr. Mike Skinner, dass er uns die Erlaubnis, ihre Agilent Bioanalyzer bedienen und hilft mit fließendem RNA-Proben zu danken.

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	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreaks+of+gastroenteritis+associated+with+noroviruses+on+cruise+ships--United+States.">Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States.</a> MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).</li><li>Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+cost+of+nosocomial+gastroenteritis,+Avon,+England,+2002-2003.">Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003.</a> Emerg. Infect. 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Chem. 281, 25315-25325 (2006).</li><li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4.">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4.</a> E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).</li><li>Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+linked+to+the+genomic+and+subgenomic+mRNAs+of+feline+calicivirus+and+its+role+in+translation.">Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation.</a> J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).</li><li>Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. 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M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+optimized+RNA-based+murine+norovirus+reverse+genetics+system.">Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system.</a> J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).</li><li>Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+mutants+of+VPg+reveal+new+cytopathology+determinants+in+a+picornavirus.">Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus.</a> PLoS One. 5, e10735 (2010).</li><li>Werf, S. v. a. n. d. e. r., Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. 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Virol. 82, 7725-7728 (2008).</li><li>Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+RNA+structures+present+at+the+3'+extremity+of+the+murine+norovirus+genome:+the+variable+polypyrimidine+tract+plays+a+role+in+viral+virulence.">Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence.</a> J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Hier haben wir zwei verschiedene Reverse genetische Ansätze, die die Rückgewinnung von infektiösen MNV in Zellkultur ermöglichen dargestellt. Beide Ansätze wirksam zu umgehen die absolute Voraussetzung für die Verknüpfung kovalent VPg an das 5&#39;-Ende des viralen RNA-Genoms über die Erzeugung der begrenzten MNV Transkripte, die dann von den zellulären Ribosomen erkannt werden. In-vitro-Transkription durch enzymatisch Capping gefolgt ist effizienter die Rückgewinnung von infektiösen MNV als Transkription von infektiösen Plasmide in Zellen, die T7-RNA-Polymerase, bei dem die Transkripte von den FPV Capping Enzyme verschlossen werden kann. Virustiter mit diesen reversen Genetik zurückgewonnen entsprechen denen, die durch Transfektion von viralen VPg-verknüpfte RNA aus infizierten Zellkulturen 17 (5) gereinigt erhalten. Die Transfektion der begrenzten MNV-RNA in permissiven RAW 264.7-Zellen macht eine Virustiter nur 1-log niedriger als Experimente mit der transfection der Gesamt-RNA aus infizierten Zellen mit viralen VPG-linked-RNA (Abbildung 5). Diese Tatsache unterstützt weitere Untersuchungen zu bestimmen, ob die Zugabe eines VPg Molekül an das 5&#39;-Ende der Transkripte von diesen Systemen erzeugten zu einer erhöhten Virusausbeuten die funktionalen Aspekte zugrunde MNV Infektiosität in Zellen zugeordnet VPg untersucht werden kann, führen. Trotzdem betrachten wir dieses System als reversen Genetik umgekehrt eine hocheffiziente ein vergleichbar mit anderen RNA-Viren Genetik Systeme, die derzeit verwendet werden, in dem die In-vitro-transkribierte RNA die Erholung der Titer nur 10-100 niedriger als im wirklichen Infektionen mit Virionen 19, 20 ermöglicht. Insgesamt stellen die aktuellen Methoden einen erheblichen Fortschritt auf dem Gebiet der Molekularbiologie und der Norovirus liefern uns die Werkzeuge, um die funktionelle Rolle von Proteinen und RNA-Motive in konservierten Norovirus Genomen zu untersuchen. Diese Konzepte wurden bereits mit C kombinierttrom Mausmodell zur Verfügung und haben gezeigt, dass MNV von infektiösen cDNA erholt ist in der Lage, tödliche Infektion von&gt; 80% STAT1-/ verursachen - Mäuse in weniger als 10 Tagen 4, 21. Die Nutzung dieses Systems haben wir tragfähige murine Norovirus Mutanten des Kapsidprotein und einer Polypyrimidintrakt bei der Bindung von verschiedenen Host-Faktoren (PTB und PCBP), dass eine etwas abgeschwächte Phänotypen zeigen in vivo 21, 22 beteiligten sich erholt haben. Darüber hinaus haben wir vor kurzem gezeigt, dass Viren die Fähigkeit fehlt, die VF1 Protein aus ORF4 effizient ausdrücken in der Zellkultur zu replizieren, aber wieder haben Virulenz in Mäusen, die mit Bezug auf WT MNV 8 reduziert. Diese Studien ermutigen uns, abgeschwächte Versionen von menschlichen Noroviren auf MNV Studien, die als potenzielle Impfstoffe untersucht werden konnte entwerfen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Lithiumchlorid Fällungslösung </td><td> Ambion </td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> RNA-Storage-Lösung </td><td> Ambion </td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7-Skript </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap m7G Capping-System </td><td> Epicentre Biotechnologies </td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td> Neon Transfektionssystem </td><td> Invitrogen </td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td> Neon Transfektionssystem Kit </td><td> Invitrogen </td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM I </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td> Agilent RNA 600 Nano-Kit </td><td> Agilent </td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 bioanalyzer </td><td> Agilent </td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Illustra GFX PCR DNA und Gel Band Purification Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7 </td><td> Promega </td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

reverse genetics mediated recovery of infectious murine norovirus

Menschliche Noroviren sind verantwortlich für die meisten Fälle von menschlichen Gastroenteritis (GE) weltweit und sind immer wiederkehrendes Problem in Umgebungen, in denen nahe stehende Person zu Person Kontakt nicht 1, 2 vermieden werden können. In den letzten Jahren ein Anstieg der Häufigkeit der Ausbrüche in Krankenhäusern wurde berichtet, was zu erheblichen Störungen ihrer operativen Leistungsfähigkeit sowie große wirtschaftliche Verluste. Die Identifizierung von neuen antiviralen Ansätzen wurde aufgrund der Unfähigkeit des menschlichen Noroviren, um eine produktive Infektion in Zellkultur 3 vervollständigen begrenzt. Die kürzliche Isolierung eines murinen Norovirus (MNV), eng mit den menschlichen Norovirus 4, aber die Suchbegriffe in Zellen 5 werden ausgebreitet hat neue Wege zur Untersuchung dieser Pathogene 6, 7 geöffnet. MNV Replikation resultiert in der Synthese der neuen positiven Sinne genomischen und subgenomischen RNA-Moleküle, entspricht die letztere zur letzten third des viralen Genoms (Abbildung 1). MNV enthält vier verschiedene offene Leseraster (ORFs), von denen ORF1 nimmt den größten Teil des Genoms kodiert und sieben nicht-strukturelle Proteine ​​(NS1-7) aus einem Polyprotein-Vorläufer-Freigabe. ORF2 und ORF3 innerhalb des subgenomischen RNA-Region enthalten ist, und codieren die Capsid-Proteine ​​(VP1 und VP2, jeweils) (1). Vor kurzem haben wir diese zusätzliche ORF4 überlappenden ORF2 identifiziert, aber in einem anderen Leseraster ist funktional und kodiert für eine mitochondriale lokalisierte Virulenzfaktor (VF1) 8. Replikation für positive RNA Viren, einschließlich Noroviren, erfolgt im Zytoplasma, was zur Synthese neuer begrenzten RNA-Genome. Um virale Übersetzung zu fördern, zu nutzen Viren unterschiedliche Strategien bei der Einstellung des zellulären Proteinsynthese-Maschinerie 11.09 abzielen. Interessant ist, dass Norovirus-Übersetzung durch die multifunktionale virale Protein-Primer VPg angetriebenkovalent an das 5&#39;-Ende der beiden genomischen und subgenomischen RNAs 12-14 verbunden. Dieser ausgeklügelte Mechanismus der Übersetzung wird wahrscheinlich ein wichtiger Faktor in der geringen Effizienz der viralen Wiederherstellung durch konventionelle Methoden der reversen Genetik sein. Hier berichten wir zwei verschiedene Strategien, die auf die Generierung von murinen Norovirus-1 (im Folgenden als MNV beiliegenden) Transkripte am 5&#39;-Ende verschlossen. Eines der Verfahren umfasst sowohl in vitro Synthese und Begrenzung der viralen RNA, während die zweite Ansatz beinhaltet die Transkription der cDNA MNV in Zellen, die T7-RNA-Polymerase. Die Verfügbarkeit dieser reversen Genetik zum Studium von MNV und einem Tiermodell eine beispiellose Fähigkeit, die Rolle von viralen Sequenzen in Replikation und Pathogenese von 15 bis 17 zu zerlegen ist.

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Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Noroviren sind eine bedeutende Ursache von Gastroenteritis noch molekulare Techniken zu ihrer Charakterisierung sind noch relativ neu. Hier berichten wir über zwei verschiedene Ansätze der reversen Genetik für die effiziente Gewinnung von murinen Norovirus (MNV), das einzige Mitglied dieser Gattung, die in Zellkultur vermehrt werden kann.

Reverse-Genetics vermittelte Wiedergewinnung eines infektiösen Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.4K Aufrufe.  Imperial College London. Noroviren sind eine bedeutende Ursache von Gastroenteritis noch molekulare Techniken zu ihrer Charakterisierung sind noch relativ neu. Hier berichten wir über zwei verschiedene Ansätze der reversen Genetik für die effiziente Gewinnung von murinen Norovirus (MNV), das einzige Mitglied dieser Gattung, die in Zellkultur vermehrt werden kann.