Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung robuster TILLING-Populationen mit hoher Mutationshäufigkeit durch EMS-Mutagenese in Kleingetreidekulturen. TILLING Populationen können für die funktionelle Genomik sowie für die Entdeckung genetischer Weltraumgene in kleinen Getreidepflanzen verwendet werden. Die TILLING-Populationen, die mit dieser Technik entwickelt wurden, weisen hohe Mutationsfrequenzen auf, und dieses Protokoll kann auf jeden Genotyp angewendet werden.
Die Cel-1-Assay-basierte Mutationsdetektion kann mit grundlegenden Laborgeräten durchgeführt werden. Der wichtigste Schritt ist die Bestimmung der optimalen EMS-Konzentration. Daher sollte eine EMS-Dosierungskurve speziell für die individuelle Population erstellt werden.
Zunächst 100 Samen mit dem Genotyp des Interesses in sechs 250-Milliliter-Glaskolben einweichen, die 50 Milliliter destilliertes Wasser enthalten. Bei 100 Umdrehungen pro Minute acht Stunden bei Raumtemperatur für imbibition schütteln. Dann, in einer Dunstabzugshaube, 50 Milliliter EMS-Lösungen in fünf verschiedenen Konzentrationen durch Mischen von EMS-Flüssigkeit und destilliertem Wasser vorbereiten.
Nach der Imbibition dekantiert das Wasser aus fünf Kolben. Fügen Sie 50 Milliliter EMS-Lösung in jede der fünf Kolben mit imprägnierten Samen. Schütteln Sie die Kolben für 16 Stunden bei 75 U/min und Raumtemperatur.
Dekantieren Sie nun die EMS-Lösung in eine leere Abfallflasche und gießen Sie die behandelten Samen auf Käsetücher, die auf eine leere Abfallflasche gelegt werden, um sie für jede Behandlung separat zu sammeln. Verwenden Sie zusätzliches Wasser, um das Gießen der Samen zu helfen. Sprühen Sie auch mehrere Milliliter EMS-Inaktivierungslösung auf die Wand von kontaminierten Kolben.
Und tauchen Sie gebrauchte Pipettenspitzen für 24 Stunden in die Lösung ein. Inaktiv die verwendete EMS-Lösung durch Hinzufügen eines Volumens von EMS-Inaktivierender Lösung für 24 Stunden zu behandeln. Mit einer Twist-Krawatte die EMS-behandelten Samen in das Käsetuch stecken und zwei Stunden unter fließendem Leitungswasser waschen.
Nach dem Waschen jedes Saatgut einzeln in Wurzeltrainer mit Blumenerde transplantieren. Wachsen Sie Pflanzen bei 20 bis 25 Grad Celsius für eine 16-stündige Lichtperiode. Überprüfen Sie nach 15 Tagen Transplantation die Pflanzen und zählen Sie die Anzahl der Samen, die nicht gekeimt haben.
Aufzeichnung von Daten über das Überleben von Pflanzen. Wenn die Überlebensrate nicht innerhalb von 40 bis 60% liegt, führen Sie eine zweite Runde der Dosierungsoptimierung mit einer modifizierten Konzentration durch, bis sie die gewünschte Letalitätsrate von 40 bis 60% nach dem Mutagenese-Experiment erreicht hat, sammeln Sie das Blattgewebe von M2-Pflanzen in einer 96-Well-Gewebe-Sammelbox. Gewebe wird aus M2-Pflanzen gesammelt, die aus selbst gezüchteten M1-Pflanzen angebaut wurden.
Aus jeder M1-Anlage wird eine M2-Anlage gezeigt. Extrahieren Sie DNA mit einem Pflanzlichen DNA-Extraktionskit mit einem DNA-Reinigungssystem nach den Empfehlungen des Herstellers. Dann laden Sie zwei Mikroliter des DNA-Extrakts in LV-Platten mit 16 Schlitzen.
Quantifizieren Sie die DNA mit einem Spektralphotometer bei Wellenlängen von 260 und 280 Nanometern. Verdünnen Sie die DNA-Konzentration auf 25 Nanogramm pro Mikroliter mit nukleasefreiem Wasser. Erstellen Sie viermal DNA-Pools von 200 Mikrolitern, indem Sie die DNA aus jedem Brunnen in den vier 96 Brunnenblöcken zu einer Poolplatte kombinieren und dabei die Zeilen- und Spaltenidentität jeder Probe beibehalten.
Als nächstes bereiten Sie eine PCR-Master-Mischröhre für genspezifische Primer vor, indem Sie in jede Röhre PCR-Puffer, Vorwärts- und Rückwärtsprimer und DNA-Polymerase gemäß dem Manuskript hinzufügen. Aliquot die Master-Mix in die Brunnen einer 96 gut PCR Platte. Fügen Sie dann die gepoolte DNA-Vorlage hinzu.
Laden Sie die PCR-Röhren in einen thermischen Cycler, und verwenden Sie ein Touchdown-Profil, um die PCR-Reaktion auf dem Thermischen Cycler auszuführen. Um Heteroduplexe zwischen nicht übereinstimmenden DNAs zu erzeugen, inkubieren Sie PCR-Produkte im thermischen Cycler in einem anderen Programm. Dann fügen Sie 2,5 Mikroliter hausgemachte Cel-1 Endonuklease zu jedem der heteroduplexierten PCR-Produkte hinzu.
45 Minuten bei 45 Grad Celsius inkubieren. Danach beenden Sie die Cel-1-Reaktion, indem Sie 2,5 Mikroliter 0,5 Mol EDTA bei pH 8 hinzufügen. 30,5 Mikroliter jedes mit Cel-1 behandelten Produktes mit fünf MikroliterFarbstoff auf ein 3%Agarose-Gel aufladen und zweieinhalb Stunden lang bei 100 Volt laufen.
Um mutierte Pools zu dekonvolute, bestimmen Sie die Zygosität von Mutanten durch zwei PCR-Reaktionen für einzelne M2-DNA, in denen die erste Reaktion enthält 2,5 Mikroliter M2-DNA und 2,5 Mikroliter wildTyp-DNA und die zweite Reaktion enthält nur fünf Mikroliter M2-DNA. Dieses Protokoll zeigt die EMS-Mutagenisierung von Kleingetreidekulturen und die Charakterisierung von Mutanten. Die Dosierungskurve zeigt optimale EMS-Dosen für die gewünschten 50%-Überlebensraten für drei verschiedene Weizenarten an.
Das Vorhandensein leicht identifizierbarer Phänotypen in der M2-Population bestätigt die Wirksamkeit der Mutagenese in kleinen Getreidepopulationen. Hier sind vier Beispiele für die mutierten Phänotypen in M2 TILLING Populationen, ein Albino-Mutant in einer Gersten-M2-Population, ein Chlorina-Mutant in einer Gersten-M2-Population, ein bunt gefärbter Mutant mit rosa Verfärbung in einer Aegiltauschi M2-Population und ein bodenniedriger Mutant in einer Triticum monococcum M2-Population. Eine mutierte Identifizierung mit Cel-1 auf Agarose-Gel-Plattformen zeigt einen potenziellen Mutantenpool, der aus 12 mutierten Pools durch einzigartige Spaltenbänder identifiziert wurde.
Die Dekonvolution von mutierten Pools bestimmte die Zygosität der Mutation und half, die Mutation bis zu einzelnen Proben zu verfolgen. Der A4-Pool hatte heterozygote Mutationen, die durch Spaltenbänder in Box 4 und Box 4 Wild-Typ-DNA-Proben angezeigt wurden. Der H5-Pool enthielt homozygote Mutationen, da einzigartige Spaltenbänder nur in Box 5 H5 Wildtyp-DNA-Proben vorhanden waren.
Der wichtigste Schritt besteht darin, die optimale Konzentration von EMS zu bestimmen, um eine Tödliche itätsrate von 40 bis 60 % zu erreichen. Sobald eine TILLING-Population mit einer hohen Mutationshäufigkeit entwickelt wurde, kann sie zur funktionellen Charakterisierung jedes Gens von Interesse verwendet werden. Darüber hinaus kann die Population eine Quelle nützlicher genetischer Variationen zur Verbesserung der Ernte sein.
TILLING wurde ausgiebig für funktionelle Genomstudien in Modell- und Kulturpflanzen eingesetzt. Der Bereich der erhaltenen Mutationen kann Fehl-, Knockouts, stille oder sogar falsch ergänzte Formen sein. EMS ist ein Mutagen.
Verwenden Sie daher beim Umgang mit dem EMS geeignete persönliche Schutzausrüstung. Dekontaminieren Sie Restlösungen und verwendete Pipettenspitzen.
