Feine Nadelaspirationszytologie ist eine kostengünstige, einfache, schnelle und minimalinvasive Technik, mit der wir Trypanosomen aus fühlbaren Läsionen in Organen bei lebenden Mäusen sammeln. Da die Feinnadelabsaugung ein nicht-terminales Verfahren ist, ermöglicht sie die wiederholte Probenahme bei demselben Tier im Laufe der Zeit. Wenn diese Ergebnisse auf Rinder übersetzt werden können, wird diese Methode für Tierärzte sehr nützlich sein, um Trypanosomiasis bei Rindern in einem Bauernhof zu diagnostizieren.
Demonstriert wird das Schmierungsverfahren von Ana Margarida Santos, einer Assistenztechnologin aus meinem Labor. Bestätigen Sie zunächst die Anästhetisierung mit der Toe Pinch-Methode. Wenn der Reflex des Zurückziehens des Beins fehlt, positionieren Sie die Maus in dorsaler Regung.
Die Hoden sorgfältig palepatieren, um die Größe und den Abstand von der darüber liegenden Haut zu bestimmen und sie dann zwischen Dem Inzeund und Mittelfinger oder zwischen Zeigefinger und Daumen zurückzuhalten. Um das Ziel weiter zu immobilisieren, dehnen Sie die darüber liegende Haut fest und reinigen Sie die Oberfläche mit Alkoholtüchern. Als nächstes legen Sie die Nadelspitze einer 23-Meter-Nadel, die mit einer Fünf-Milliliter-Spritze verbunden ist, in das Ziel ein, um sicherzustellen, dass sich der Kolben im Ruhezustand befindet.
Um die Saugkraft anzuwenden, ziehen Sie den Spritzenkolben zwei- bis dreimal auf die Drei- bis Vier-Millimeter-Marke ein. Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, eine repräsentative Probe zu erhalten und kleinere Strukturen wie die Epididymis anzusprechen, leiten Sie die Nadel innerhalb des Organs entweder in einer geraden Linie oder entlang mehrerer verschiedener Tangenten um. Lassen Sie die Absaugung los und ziehen Sie dann die Nadel zurück.
Die Nadel kann erst entfernt werden, nachdem der Unterdruck durch Loslassen des Kolbens freigesetzt wurde. Andernfalls wird das Aspirat in die Spritze gesaugt und ist unwiederbringlich. Wenden Sie Druck mit einem sterilen Gazeschwamm an der Punktionsstelle an, um blutungsmittel zu kontrollieren.
Trennen Sie die Spritze von der Nadel und füllen Sie sie mit Luft. Schließen Sie die Nadel wieder an, legen Sie die Spitze der Nadel sehr nah an oder sogar auf die Rutsche und werfen Sie den Inhalt der Nadel vorsichtig auf die Rutsche. Um eine Replizionsprobe zu gewährleisten, führen Sie mindestens eine zusätzliche Aspiration pro Organ und Tier durch.
Nach der Rückkehr der Anästhesie mit einer subkutanen Injektion von 200 Mikrolitern von einem Milligramm pro Kilogramm Atipamezol in der Saline, bringen Sie die Tiere zur Genesung in ihren Heimischenkäfig zurück. Nehmen Sie mit der nicht dominanten Hand die Folie auf, die den Tropfen des Aspirats hat, das das gefrostete Ende zwischen Daumen und Zeigefinger kneifen. Mit der dominanten Hand, nehmen Sie eine saubere Streuerrutsche und legen Sie es glatte saubere Kante über die zweite Rutsche nur auf der Oberseite des Tropfens in einem Winkel von etwa 30 Grad.
Um einen dünnen Film zu erhalten, gleiten Sie die Rutsche mit einer leichten kontinuierlichen und stetigen Bewegung nach vorne. Ruhen Sie den Schlitten und ermöglichen Sie die vollständige und schnelle Lufttrocknung des Materials. Beschriften Sie den mattierten Rand der Folie mit einem Bleistift.
Für das Giemsa-Färbeprotokoll, fixieren Sie luftgetrocknete Abstriche, indem Sie die Dias fünf Minuten lang in ein Coplin-Glas mit 100% Methanol eintauchen. Dann die Dias in ein Coplin-Glas mit 20%Giemsa-Lösung und destilliertem Wasser für 30 Minuten übertragen. Spülen Sie die Dias in Leitungswasser und tumbern Sie mit Tissuepapier gründlich trocknen.
Während Sie den Schlitten horizontal halten, mehrere Tropfen nicht wässriger Montagemedium auf den Abstrich auftragen. Legen Sie die Kante eines Deckglases auf die Folie, senken Sie sie und drücken Sie vorsichtig, um Luftblasen zu entfernen. Für die Immunzytochemie, fix luftgetrocknete Abstriche in 100%Methanol bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
Waschen Sie die Folie für fünf Minuten in einem Coplin-Glas mit 1X PBS wiederholen diesen Schritt dreimal mit frischen 1X PBS jedes Mal. Nachdem Sie die Dias aus dem Coplin-Glas entfernt haben, wischen Sie den überschüssigen Puffer ab, ohne den Abstrich zu berühren, und ziehen Sie eine Linie um den Abstrich mit einem wasserabweisenden Stift. Während Sie die Folie horizontal halten, 150 Mikroliter verdünnter Primärantikörperlösung auf jeden Abstrich auftragen und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
Waschen Sie die Dias nach der Inkubation fünf Minuten lang in einem Coplin-Glas mit 1X PBS, die diesen Schritt dreimal mit frischen 1X PBS jedes Mal wiederholen. Während Sie die Folie horizontal halten, wenden Sie 150 Mikroliter handelsüblichen Pferderettichperoxidase DAB Visualisierungssystems auf jeden Abstrich an und brüten dann 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Dias erneut dreimal für fünf Minuten in PBS.
Dann kontern Sie, indem Sie die Dias für 10 Sekunden in ein Coplin-Glas mit Harris Hämatoxylin eintauchen. In Leitungswasser abspülen und mit Papier zum Trocknen abdünnen. Während Sie den Schlitten horizontal halten, mehrere Tropfen nicht wässriger Montagemedium auf den Abstrich auftragen.
Legen Sie die Kante eines Deckglases auf die Folie, senken Sie sie und drücken Sie vorsichtig, um Luftblasen zu entfernen. Ein hochwertiger Abstrich zeichnete sich durch eine Monoschicht von Zellen mit guter Dichte und erhaltenen morphologischen Merkmalen aus, die die Identifizierung ihres Ursprungsgewebes und des relativen Verhältnisses zwischen einander ermöglichten. Darüber hinaus wurden Parasiten effizient immungefärbt, identifizierbar und zählbar.
Schlechte oder negative Feine Nadelabsaugungsergebnisse können auf zu wenig Material und damit unter repräsentativ für die Masse oder das Organ zurückzuführen sein. Es kann auch an zu viel Material auf einem einzelnen Dia zurückzuführen sein, das zu dicke Abstriche und eine beeinträchtigungde zytologische Bewertung macht. Sogenannte zerkleinerte Artefakte entstehen aufgrund zu viel Kraft, die angewendet wird, wenn der Abstrich zu gestörten Zellen hinterlassen wird, was zu vielen nackten Kernen und DNA-Streifen führt.
Wenn bei der Abstrichvorbereitung nicht genügend Kraft angewendet wird, disaggregieren die Zellen nicht, was zu einer geschichteten Schicht führt, die die Bewertung der morphologischen Merkmale der Zellen behindert. Der Vergleich der Feinnadelaspirationszytopathologie mit der Histopathologie, der Zytopathologie hatte den Vorteil einer besser erhaltenen zellulären Morphologie und einer besseren Bewertung der relativen Proportionen und der Zählung der Zellen. Die Immunzytochemie ist einfacher, schneller und einfacher zu optimieren als die Immunhistochemie.
Für feine Nadelabsaugung, immer eine gute Immobilisierung des Tieres, Stabilisierung der Organe oder Masse angesaugt werden, und eine koordinierte Vakuum-Anwendung und Freisetzung. Dann für hochwertige Abstriche, sofort verteilen, nachdem das Material auf das Glas gelegt wurde und sanft auf die Stärke angewendet werden, um den Abstrich zu machen, um Zelle zerkleinert Artefakte zu vermeiden. Neben der Routinemikroskopie und Immunzytochemie kann dieses Material auch für Elektronenmikroskopie, biochemische Analyse, Durchflusszytometrie, Molekularbiologie oder sogar für In-vitro-Assays verwendet werden.
Diese Technik ermöglichte es uns zu zeigen, dass feine Nadelabsaugung verwendet werden kann, um Krankheiten bei Versuchstieren zu diagnostizieren und zu studieren. Wir waren in der Lage, Tropismus von Trypanosoma Parasiten zu den äußeren männlichen Fortpflanzungsorganen zu diagnostizieren und auch diese Krankheit im Verlauf der Infektion zu charakterisieren.
