Dieses Protokoll ermöglicht die Ableitung von sympathischen Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. Diese Zellen werden es einem Wissenschaftler ermöglichen, menschliche Störungen zu untersuchen, die das sympathische Nervensystem beeinflussen. Diese Technik ermöglicht die Ableitung von sympathischen Neuronen in geteilten feederfreien Meetingbedingungen bei hoher skalierbarer Effizienz.
Es führt zu elektrisch aktiven Neuronen in 20 Tagen. Diese Technik kann auf Krankheiten angewendet werden, die durch ein dysfunktionales sympathisches Nervensystem verursacht werden, es kann auch für die Modellierung von Krankheiten, regenerative Medizin und Arzneimittelscreening verwendet werden. Diese Zellen könnten in vitro verwendet werden, um jedes Gewebe innerhalb eines Co-Kultur-Systems zu innovieren, zum Beispiel für die Untersuchung der Herzgeweberegulation.
Wenn die menschliche pluripotente Stammzellkultur 80 bis 90% Konfluenz erreicht, sollten große Kolonien mit glatten hellen Rändern beobachtet werden. Zum Aufspalten die Kultur mit PBS waschen, bevor Sie die Zellen mit vier Millilitern von 0,25 Molaren EDTA bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid behandeln. Nach zwei Minuten die Platte mit 10 Milliliterem E8-Medium spülen und die abgetrennte Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Konusrohr übertragen.
Dann 500 Mikroliter Zellen in ein 9,5 Milliliter Aliquot frisches E8-Medium übertragen. Und die Stammzellen auf neue vitronectin beschichtete 100-Millimeter-Schalen aufstellen. Einen Tag vor der Differenzierungsinduktion die entsprechende Anzahl von sechs Brunnenplatten mit zwei Millilitern Kellermembranmatrix pro Brunnen beschichten.
Und die Teller über Nacht bei vier Grad Celsius lagern. Am nächsten Morgen die Teller auf Raumtemperatur erwärmen und die bereit, die menschliche pluripotente Stammzellkultur zweimal mit frischem PBS pro Wäsche zu teilen. Nach der zweiten Wäsche behandeln Sie die Zellen mit sieben Millilitern 0,5 Millimolar EDTA 15 Minuten lang im Zellkultur-Inkubator, bevor Sie die schwimmenden menschlichen pluripotenten Stammzellen anspornen und die geernteten Zellen in eine 50-Milliliter-Röhre übertragen.
Fügen Sie dem Rohr ein gleiches PBS-Volumen hinzu, um die EDTA zu verdünnen und die Zellen durch Zentrifugation zu sammeln. Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter Tag 01 Differenzierungsmedium aus, bevor Sie ein entsprechendes Mediumvolumen für die Buchhaltung hinzufügen. Verdünnen Sie die Zellen auf 1,25 mal 10 bis die fünfte Zelle pro Quadratzentimeter Konzentration in Milliliter Differenzierungsmedium pro Brunnen.
Aspirieren Sie die gesamte Kellermembranmatrixlösung aus jedem Brunnen der zuvor auf sechs Wellplatten vorbereiteten Wellplatte. Dann säen Sie zwei Milliliter Zellen in jeden Brunnen und legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator. Am nächsten Morgen füttern Sie die Zellen mit drei Millilitern Tag 01 Differenzierungsmedium pro Brunnen.
Am zweiten Tag der Differenzierung, füttern Sie die Zellen mit drei Milliliter n. Tag zwei bis 10 Differenzierungsmedium pro Brunnen, dann füttern Sie die Zellen jeden zweiten Tag bis Tag 10. Um die neuralen Kammzellen zu Sphäroiden zu aggregieren, waschen Sie die Zellen am 10. Tag mit PBS. Und fügen Sie zwei Milliliter Dissoziationsmedium zu jedem Brunnen.
Nach 20 Minuten im Zellkultur-Inkubator die schwimmenden Zellen in ein 50-Milliliter-Konusrohr übertragen und das Suspensionsvolumen in der Röhre mit frischem PBS auf 50 Milliliter erhöhen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Und setzen Sie das Pellet in einem ausreichenden Volumen von Tag 10 bis 14 Sphäroid medium zum Zählen wieder aus.
Nach dem Zählen, verdünnen Sie die Zellen auf eine fünf mal 10 bis die fünfte Zelle pro 500 Mikroliter Konzentration mit Tag 10 bis 14 Sphäroid Medium. Und Platte 500 Mikroliter Zellen in jeden Brunnen einer ultra niedrigen Befestigung 24-Well-Platte. Kehren Sie dann die Zellen an den Zellkultur-Inkubator zurück.
Um eine minimale Sphäroidkultur zu induzieren, füttern Sie am 11. Tag der Kultur die neuralen Kammsphäroide mit zusätzlichen 500 Mikrolitern tag 10 bis 14 Sphäroidmedium pro Brunnen. Neigen Sie die Platte am 12. Tag, um die Sphäroide auf einer Seite der Platte anzusammeln. Und sorgfältig so viel Medium wie möglich aus jedem Brunnen ohne animierende Sphäroide aspirieren.
Dann füttern Sie die Sphäroide mit einem Milliliter Tag 10 bis 14 Sphäroid Medium pro Brunnen. Um eine erweiterte Sphäroidkultur zu induzieren, füttern Sie am 15. Tag die Sphäroide mit 1,5 Millilitern Tag 10 bis 14 Sphäroidmedium, ergänzt mit 0,5 Mikromolar-Retinsäure pro Brunnen. Dann kehren Sie die Sphäroide an den Zellkultur-Inkubator zurück.
Für eine sympathische Neuronendifferenzierung, am Tag 14 oder 28, kippen Sie die Platte, um die Sphäroide auf einer Seite der Platte zu akkumulieren und sorgfältig so viel Medium wie möglich zu aspirieren. Füttern Sie die Zellen mit einem Milliliter sympathischen Neuronmedium. Um große Sphäroidaggregate in kleinere Sphäroide aufzuteilen, fügen Sie nicht mehr als einen Milliliter Medium pro Brunnen hinzu und pipette die Sphäroide fünf bis zehn Mal vor dem Aufteilen.
Und entfernen Sie das überschüssige Laminin-Fibronectin von zuvor vorbereiteten 24-Well-Platten. Teilen Sie die Platte einen Milliliter Sphäroide aus jedem Brunnen auf die 24-Wells Sphäroid-Kulturplatte zwischen vier separaten Brunnen der neu beschichteten 24-Well-Platte. Fügen Sie 250 Mikroliter frisches sympathisches Neuronmedium zu jedem Brunnen hinzu.
Und legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie am nächsten Morgen das Medium in jedem Brunnen durch einen Milliliter sympathischen Neuronmedium, ergänzt durch 0,125 Mikromolar-Retinsäure, und geben Sie die Platte an den Zellkultur-Inkubator zurück. Nach Tag 35 füttern Sie die Neuronen, indem Sie sorgfältig nur die Hälfte des vorhandenen Mediums in jedem Brunnen durch frisches Medium ersetzen.
Vor der Differenzierung sollten die menschlichen pluripotenten Stammzellkolonien mit glänzenden, glatten Kanten und wenig bis gar keiner Differenzierung rund sein. Die Zellen drücken den neuralen Kammmarker Sox10 von den Tagen vier bis zehn aus. Neurale Kammzellen entstehen in dichten abgedunkelten Graten, die ab dem sechsten Tag sichtbar sind.
Diese Grate drücken auch Sox10 aus. Im Stadium der neuralen Kammzellen korreliert Sox10 mit dem Zelloberflächenmarker CD49D, der verwendet werden kann, um die neuralen Kammzellen zu sortieren. Positiv sortierte und unsortierte Populationen produzierten neurale Kammsphäride in ähnlicher Weise.
Während negativ sortierte Zellen nicht richtig aggregieren, produzieren Sie keine runden, glatten, gesund aussehenden Sphäroide und sterben innerhalb von drei bis vier Tagen. Wenn an Tag 14 die quantitative Reverse-Transkriptase-PCR für neurale Kamm- und sympathische Nervenvorläufermarker verglichen wird, können signifikante Unterschiede zwischen den sortierten und unsortierten Zellen nicht nachgewiesen werden. Am 20. oder 35. Tag, den jeweiligen minimalen oder erweiterten Protokollen, können Neuroiden beobachtet werden, die in einem radialen Muster aus den beigefügten Sphäroiden wachsen.
Marker im Zusammenhang mit Noradrenalin-Synthese und Transport werden in diesem Stadium ausgedrückt, sowie Hox6 durch neun Stamm neurale Kamm Gene. Elektrophysiologische Aufzeichnung erkennt auch neuronale Aktivität ab Tag 20. Solche Aktivität kann durch Medikamente verbessert oder unterdrückt werden, die Autorezeptoren von sympathischen Neuronen, die die Funktionalität von differenzierten Neuronen anpassen ziel.
Der menschliche Befürworter selbst muss gesund sein, beginnend am Tag Null der Differenzierung, sonst wird das Experiment wahrscheinlich scheitern. Pharmakologische Inhibitoren oder Aktivatoren können den Neuronen hinzugefügt werden, um ihr normales oder pathologisches Verhalten zu verstehen. Diese Methode eröffnet einen neuen Weg für das Studium sympathischer Biologie und Pathologie, da es nun leicht möglich ist, Biopsien sympathischer Neuronen vom Menschen zu erhalten.
