Zuverlässige Tiermodelle sind entscheidende Bestandteile der Grundlagenforschung. Unser muriner Ansatz ermöglicht die Beantwortung immunologischer Fragen zur Mechanistik und Kinetik der entwicklung akuter Lungenverletzungen bei Säugetieren. Minimale Invasivität, einfache Handhabung sowie gute Reproduzierbarkeit sind die Hauptvorteile dieser Technik.
Darüber hinaus können wir mit Dosistitration die klinische Wirkung modulieren. Diese Technik spiegelt die klinische Situation von Patienten mit schweren Lungenverletzungen wider und ermöglicht es, die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Lipolpolysaccharid oder LPS in Aliquots bei einer Konzentration von fünf Milligramm pro Milliliter bei minus 20 Grad Celsius lagern.
Zur intratrachealen Instillation das aufgetaute LPS in steriler Phosphat-gepufferter Saline auf eine Endkonzentration von 2.000 Mikrogramm pro Milliliter verdünnen. Schneiden Sie einen 22-Spur-Venenkatheter auf eine Länge von 20 Millimetern. Platzieren Sie die Maus in der anfälligen Position auf einem temperaturgeregelten Tisch, um eine Körpertemperatur von 37 Grad Celsius zu halten.
Nach der Anästhesie, wie im Textprotokoll beschrieben, verwenden Sie steriles ophthalmologisches Schmiermittel, um das Austrocknung sikulierender Hornhäuten unter Anästhesie zu verhindern. Heben Sie den Kopf und Haken Schneidezähne auf einem horizontalen Balken etwa fünf Zentimeter über dem Tisch positioniert, während die Vorpaws in engem Kontakt mit dem Tisch bleiben. Super-Extend den Hals in einem 90-Grad-Winkel relativ zum Tisch.
Legen Sie eine kalte Lichtquelle auf die Haut über dem Kehlkopf, um die Stimmbänder zu visualisieren und auf die Luftröhre zu zielen. Halten Sie die Zunge mit Zange, um die Kehle für einfachere Intubationsbedingungen zu begradigen. Die richtige Visualisierung und Identifizierung des Kehlkopfes ist entscheidend, um eine korrekte intratracheale Platzierung des Katheters zu gewährleisten.
Eine externe Kaltlichtquelle hilft dabei. Setzen Sie den Katheter ca. 10 Millimeter in die Luftröhre ein. Stellen Sie sicher, dass die Einfügung nicht zu tief ist, da dies zu einer einseitigen Instillation von Flüssigkeit in den rechten oder linken Hauptbronchus führt.
Wenn Widerstand des Kehlkopfes auftritt, ziehen Sie den Katheter ein paar Millimeter zurück, bevor Sie wieder vorrücken. Injizieren Sie nun das LPS-verdünnte MPBS mit einer Pipette. Das injizierte Volumen hängt vom Körpergewicht der Maus ab.
Schließen Sie eine Spritze an und fügen Sie einen Bolus von 50 Mikroliter Luft hinzu, um sicherzustellen, dass das gesamte Flüssigkeitsvolumen in der Lunge verteilt ist. Entfernen Sie den Katheter langsam. Halten Sie den Oberkörper der Maus 30 Sekunden lang in aufrechter Position, um ein Auslaufen der Flüssigkeit aus der Luftröhre zu vermeiden.
Befestigen Sie die eingeschläferte Maus mit Klebeband auf einem Operationstisch und desinfizieren Sie das Fell kurz mit 70% Ethanol über dem Bauch. Öffnen Sie die Bauchhöhle vorsichtig in der Medianlinie mit Schere und Pinzette. Entfernen Sie Teile des Darms, um Zugang zur Vena cava minderwertiges Recht auf die Wirbelsäule in der Bauchaorta zu erhalten.
Suchen Sie die Nierenvenen und legen Sie eine gebogene Kanüle mit 23 Messgeräten, die mit einer Ein-Milliliter-Spritze verbunden ist, in die Vena cava inferior, direkt unterhalb des Zusammenflusses der Venen, ein. 250 Mikroliter Blut ansaugen und in ein 1,5-Milliliter-Rohr mit 20 Mikrolitern 0,5-Mol-EDTA-Lösung übertragen. Schütteln Sie sanft, um das EDTA-Mischen zu erleichtern und legen Sie die Röhre auf Eis.
Für bronchoalveolare Spülung drei Ein-Milliliter-Spritzen mit jeweils 0,5 Millilitern sterilem PBS und 0,1 Milliliter Luft vorbereiten. Das Fell des Halses mit 70% Ethanol desinfizieren und die Luftröhre vorsichtig mit Schere und Pinzette aussetzen. Mobilisieren Sie die Luftröhre und wickeln Sie eine Naht um sie.
Punktieren Sie die Luftröhre mit mikroscheren und legen Sie einen 22-Spur Venenkatheter, geschnitten auf eine Länge von 20 Millimetern. Fixieren Sie den Katheter mit einer Naht und instillieren Sie 0,5 Milliliter steriles PBS und 0,1 Milliliter Luft. Die Flüssigkeit nach 60 Sekunden ansaugen.
Wiederholen Sie den Vorgang mit den zusätzlichen zwei Spritzen und sammeln Sie das gesamte Aspirat in einem 15 Milliliter Rohr auf Eis. Öffnen Sie den Thorax vorsichtig mit Schere und Pinzette, um die Lunge zu ernten. Schneiden Sie die Membran entlang der Kostenrand und schneiden Sie durch die Rippen mit zwei seitlichen Schnitten.
Vermeiden Sie vorsichtig, die Lunge zu punktieren. Heben Sie das Brustbein kranich an und fixieren oder entfernen Sie es. Bereiten Sie zwei 10 Milliliter Spritzen mit warmen, 37 Grad Celsius PBS vor.
Machen Sie einen kleinen Schnitt in den linken Ventrikel. Punktieren Sie den rechten Ventrikel mit einer 26-Spur-Kanüle. Dann spülen Sie die Lungenzirkulation mit einem vorgewärmten PBS.
Beachten Sie, dass die Lunge während des Eingriffs blass wird. Entfernen Sie den rechten Lappen der Lunge und schneiden Sie ihn in Die Hälften. Snap frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein, gefolgt von einer Langzeitlagerung bei minus 80 Grad Celsius für weitere Genexpression und Proteinanalyse.
Entfernen Sie die gesamte linke Lunge und homogenisieren Sie sie in einer 48-Well-Platte, indem Sie das Gewebe mit Schere und Pinzette zerlegen. Inkubieren Sie das Gewebe in zwei Milliliter Verdauungspuffer bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten. Führen Sie eine weitere Homogenisierung durch sorgfältiges Pipettieren der Lungengewebestücke nach oben und unten durch.
Übertragen Sie die Blutproben in fünf Milliliter FACS-Röhrchen und mischen Sie das Blut vorsichtig mit zwei Millilitern roter Blutzelllysepuffer. Legen Sie die Rohre auf Eis und beenden Sie die Reaktion nach zwei Minuten, indem Sie zwei Milliliter eiskalte PBS hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Probe für fünf Minuten bei 400 mal g und entsorgen Sie den Überstand.
Setzen Sie das Zellpellet mit 60 Mikroliter FACS Puffer und Prozess für die nachfolgende FACS Färbung nach zuvor beschriebenen Protokollen aus. Zentrifuge BAL-Flüssigkeit für fünf Minuten bei 400-fachem g. Den Überstand ansaugen und in flüssigem Stickstoff einfrieren, gefolgt von einer Langzeitlagerung bei minus 80 Grad Celsius für weitere Proteinanalysen.
Nach dem Wiederaufsetzen des BAL-Zellpellets mit zwei Milliliterkaltem FACS-Puffer, übertragen Sie die Suspension in ein fünf Milliliter FACS-Rohr mit einem 100-Mikron-Netzfilter, um Haare zurückzuhalten. Nach der erneuten Zentrifugierung der Probe das Pellet mit 60 MikroliterFACS-Puffer wieder aufsetzen und für die nachfolgende FACS-Färbung nach zuvor beschriebenen Protokollen verarbeiten. Übertragen Sie nun das verdaute linke Lungengewebe in ein FACS-Rohr mit fünf Millilitern, indem Sie einen 100-Mikron-Netzfilter verwenden, um Klumpen zu extrahieren.
Beenden Sie den Verdauungsprozess, indem Sie zwei Milliliter eiskalten FACS-Puffer hinzufügen, bevor Sie die Probe fünf Minuten lang bei 400 mal g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit 60 MikroliterFACS-Puffer und Prozess für nachfolgende FACS-Färbung nach zuvor beschriebenen Protokollen wieder aus. Für eine FACS-Analyse fügen Sie 20 Mikroliter CD16/CD32-Antikörperblockierungslösung zu 60 Mikroliter Zellen in einer Fünf-Milliliter-Röhre hinzu.
Inkubieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius für 15 Minuten, um die unspezifische Bindung von Immunglobulin an die Fc-Rezeptoren zu blockieren. Bereiten Sie in der Zwischenzeit einen Master-Mix mit FACS-Puffer und Antikörpern vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Waschen Sie die Zellen nach dem Blockieren nicht.
Fügen Sie 20 Mikroliter Antikörper-Master-Mix pro Probe hinzu, um ein Endvolumen von 100 Mikrolitern zu erhalten. Inkubieren Sie die Proben für 20 Minuten, im Dunkeln, bei vier Grad Celsius. Waschen Sie jede Probe wie bisher mit einem Milliliter FACS-Puffer und Zentrifuge.
Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit FACS-Puffer auf die entsprechende Zellkonzentration für FACS-Messungen aus. Fügen Sie schließlich jede Probe feste Anzahl kommerziell erhältlicher fluorchromgekoppelter Kalibrierperlen hinzu, um absolute Zellzahlen zu bestimmen. Führen Sie die Durchflusszytometrie mithilfe der im Textprotokoll für Blut-, BAL- und Gewebezellen gezeigten Gating-Strategie durch.
24 sowie 72 Stunden nach intratrachealer Instillation wurde die Expression von TNF-alpha im Lungengewebe signifikant hochreguliert und erreichte einen anhaltenden und mehr als 50-fachen Anstieg im Vergleich zu den Kontrolltieren. Leukozyten-Invasion in Gewebe und Alveolarraum ist ein Kennzeichen und charakteristisch für die Entwicklung von akuten Lungenverletzungen. Die FACS-Analyse ergab eine signifikante Infiltration von neutrophilen Granulozyten in das Lungeninterstitium, wobei sich die absolute Zellzahl im Vergleich zu den Kontrollen nach 24 Stunden fast verneunfacht hat.
Die absolute neutrophile Granulozytenzahl ging nach 72 Stunden leicht zurück, der Faktoranstieg im Vergleich zu den Kontrollen blieb jedoch bestehen. In Übereinstimmung mit der interstitiellen neutrophilen Granulozyteninfiltration wurde die MMP-9-Expression im gesamten Lungengewebe ebenfalls über den gesamten Beobachtungszeitraum signifikant erhöht. Neutrophile Granulozyten wurden nicht nur im Lungengewebe, sondern auch in der BAL-Flüssigkeit erhöht.
Der Faltenzuwachs im Vergleich zu Kontrolltieren war ausgeprägter als im Lungengewebe. Lungenödeme aufgrund einer schweren Beeinträchtigung der Alveolokapillarbarriere ist pathognomononisch für die Entwicklung einer akuten Lungenverletzung. Die Analyse des Albumengehalts in BAL-Flüssigkeit durch ELISA ergab einen signifikanten Verlust der Barrierefunktion nach 24 Stunden und 72 Stunden nach der LPS-Instillation.
Die richtige Katheterplatzierung ist für die bilaterale Instillation von LPS von entscheidender Bedeutung. Oft deuten Veränderungen der Atemwege, wie Husten oder Vergasen, auf eine korrekte intratracheale Instillation der Flüssigkeit hin. Nach der Induktion einer akuten Lungenverletzung können eine Reihe von Folgeschritten durchgeführt werden, wie z.B. FACS-Analyse, PCR, ein Proteinnachweis, um die jeweiligen Forschungsfragen zu beantworten.
