Die Autoren danken der VA-MD Regional College of Veterinary Medicine für die Bereitstellung von Kern-und technische Unterstützung für dieses Projekt. Diese Arbeit wird durch ein NIH Career Development Award (K01DK092355) unterstützt.

Alle Untersuchungen wurden im Rahmen der Genehmigung des Institutional Care und Verwenden Committee (IACUC) für Virginia Tech und in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. 1. Intratracheale (es) Inokulation von LPS Mit Oropharyngeale Verwaltung <ol><li> Stellen Sie sicher, dass jedes Tier ist einzigartig entweder ein Ohr Schlag, Ohrmarke oder andere institutionell anerkannte Methode identifiziert. </li><li> Notieren Sie die Ausgangskörpergewicht und die Körpertemperatur für jedes Tier. </li><li> Bereiten Sie die Arbeits Bestand von LPS. Jede Maus wird mit 50 ul Dosis von 1 mg / kg LPS in 1 × phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) erhalten. Mock-behandelten Tiere erhalten eine Dosis von 50 ul 1x PBS. </li><li> Bereiten Sie eine entsprechende Kammer für die Verwaltung von Isofluran mit dem folgenden Drop-Methode. Institutionelle Leitlinien variieren hinsichtlich der Verwendung von Isofluran und anderen Narkosemitteln und vor der initiatten keine Studien sollten Personen, Abteilung Tierpflege / Wohlfahrt ihre Institution wenden, um sicherzustellen, die alle Richtlinien hinreichend erfüllt werden. Wenn Isofluran-Drop-Methode ist keine Option, anderen Narkosemitteln sind akzeptable Alternativen. <ol><li> In einem geeigneten Sicherheitsschrank, gelten etwa 3 ml Isofluran zu einem gefalteten absorbierenden Papiertuch und in den Boden eines 500 ml-Becherglas. </li><li> Legen Sie ein kleines Stück Aluminiumfolie auf der Oberseite des Papiertuch abdecken und das Becherglas mit einem transparenten Deckel. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Instrumente und Reagenzien, die es während der Impfung verwendet wird. Positionieren Sie das Gummiband, das sichern die Tiere den Kopf auf das Intubation Stand wird. Dieses Verfahren wird ein Paar von geraden Zangen, ein Paar von abgewinkelten oder gebogenen Pinzette und ein p200 mit Spitzen erfordern. </li><li> Last 50 ul von LPS in die Pipettenspitze und in einer leicht zugänglichen Lage neben dem Stand der Intubation. </li><li> Anesthetize der Mausindem das Tier in die Kammer Isofluran und Abdecken der Kammer mit dem transparenten Deckel. Beachten Atemmuster des Tieres, der schnell und flach sein wird, wenn in der ersten Kammer angeordnet. Das Tier ausreichend betäubt werden, wenn die Atmung Raten heran 1 Atemzug / 2 sec, die in der Regel innerhalb von 30 Sekunden der Platzierung in der Kammer erreicht ist. Die Maus sollte betäubt werden, wie in der zugelassenen Tier-Protokoll mit Isofluran-Drop-Methode bilanziert. </li><li> Entfernen Sie den narkotisierten Maus aus der Kammer und die Aussetzung der Tier auf der Intubation stehen mit ihrem vorderen Schneidezähne. Versichern, dass das Tier sicher zurückgehalten und der Mund-und Zungen zugänglich sind. </li><li> Sichern Sie vorsichtig die Zunge mit den geraden Pinzette. Fassen Sie die Zunge mit den abgewinkelten Pinzette und ziehen Sie sie vorsichtig aus dem Mund, bis ein leichter Widerstand zu spüren ist. Diese Maßnahme reicht aus, um den Kehldeckel zu blockieren und Zugang zu der Luftröhre. </li><li> Während Sie die Zunge in die haltenausgefahrenen Position, die Verwaltung der 50 ul Dosis von LPS in die Rückseite der Kehle und Nase des Tieres sofort Abdeckung mit einem behandschuhten Finger. Das LPS wird in der Rückseite der Kehle sichtbar, bis die Maus einatmet. </li><li> Weiterhin die Nase bedecken und halten Sie die Zunge für 5-10 zusätzliche Atemzüge erweitert. </li><li> Entfernen Sie die Maus von der Intubation Stand und legen Sie das Tier wieder in einen neuen Käfig, bis er aus der Narkose erholt. </li><li> Überwachung Surrogatmarker mit Fortschreiten der Krankheit verbunden sind. Körpergewicht und die Körpertemperatur sollten alle 4-8 h für die Dauer der Studie überwacht. Ebenso beurteilen Verhaltensmerkmale und klinische Symptome, die mit einer erhöhten Morbidität verbunden. </li><li> Um den Krankheitsverlauf, Zwergmäuse zu bestimmten Zeitpunkten nach der LPS-Exposition zu beurteilen. Typische Zeitpunkte für die Ernte nach der LPS-Exposition sind 0, 6, 12, 18, 24 und 48 Stunden. Um eine Wiederherstellung und Überlebens bewerten, bewerten die Mäuse für 7 days nach der Inokulation. </li></ol> 2. Serum-und bronchoalveolären Lavage (BAL) Sammlung <ol><li> Sacrifice Sie die Maus über ein institutionell anerkannte Methode. </li><li> Legen Sie das Tier auf den Rücken und befestigen Sie es an eine Obduktion Karte, die optimal in 0,5 (1,27 cm) in der Höhe. </li><li> Befeuchten Sie die gesamte Maus mit 70% Ethanol. </li><li> Mit einer 1-ml-Spritze mit einer 27 G-Nadel, eine Herzpunktion durchzuführen, bevor irgendwelche Einschnitte. Es sollte möglich sein, 500-800 ul Vollblut von einem einzigen Mausklick zurücktreten. </li><li> Entfernen Sie die Nadel aus der Spritze und übertragen das ganze Blut zu einem vormarkiert 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zur Serumgewinnung ermöglichen das Vollblut für mindestens 30 min bei Raumtemperatur koagulieren. Zusätzlich zur Serumgewinnung, kann dieses Verfahren auch durch Einarbeiten eines Antikoagulans in das Rohr und Spritze vor dem Sammeln des Vollbluts, zu studieren zirkulierenden Immunzellen verändert werden. </li><li> Machen Sie einen horizontalen Schnitt einqueren die Länge der Peritonealhöhle und einen vertikalen Schnitt von der Peritonealhöhle zu dem Unterkiefer des Maus. </li><li> Mit einer Pinzette, fassen die beiden Seiten des Einschnitts und ziehen Sie die Haut von den zugrunde liegenden Peritoneal-und Brusthöhle. </li><li> Einen großen Einschnitt entlang der Länge der Bauchhöhle von den Genitalien auf dem Brustbein, wobei darauf zu vermeiden, schneiden die Membran. Leicht verschieben die Eingeweide in die Bauchhöhle, um den Zugang zu einer der Nieren zu ermöglichen. </li><li> Schneiden Sie die Nierenvene, die zur Niere als Drainagepunkt für die Durchblutung zu dienen. </li><li> Nick die Membran mit einer Schere, kümmert sich um die Lunge und Herz zu vermeiden, um die linke Seite des Herzens aus. </li><li> Manuell Perfusion des Herzens unter Verwendung einer 10 ml-Spritze mit einer 27 G Nadel und 1x PBS-Lösung. Vermeiden Sie die Anwendung exzessiver Gewalt während der Durchblutung, um sicherzustellen, dass die Kochsalzlösung ist nicht in die Lungen gepresst. Das restliche Blut sollten aus der Pfortader Einschnitt abtropfen lassen.</li><li> Schneiden Sie vorsichtig den Brustkorb entlang des Brustbeins mit stumpf / stumpf Schere, wobei darauf zu vermeiden, schneiden das Herz und die Lunge. Versehentlich Schneiden der Lunge während dieser Prozedur wird die Menge der gesammelten BALF deutlich zu reduzieren und wird in einer Unfähigkeit, richtig aufblasen die Lungen mit Fixiermittel führen. </li><li> Sanft isolieren das Herz und die Lunge aus dem Brustkorb mit einer Pinzette. Jeden Abschnitt des Brustkorbs mit stumpf / stumpf Schere so nah an der Wirbelsäule wie möglich vorsichtig geschnitten und vollständig zu entfernen beide Abschnitte. </li><li> Trennen Sie die Speicheldrüsen mit einer Pinzette oder entfernen Sie sie mit einer Schere, um die Luftröhre freizulegen. </li><li> Schneiden Sie vorsichtig die Muskeln, die die Luftröhre überlagern mit einer Schere. Es ist wesentlich, dass der Luftröhre dabei nicht geschnitten werden. </li><li> Mit einer Schere, trennen Sie die Schlüsselbein, die über der Luftröhre. </li><li> Fassen Sie die Thymusdrüse mit einer Pinzette und heben das Gewebe vom Herzen. Entfernen Sie die Thymusdrüse mit einer Schere, während die Pflege zuvermeiden Schneiden des Herzens oder der Lunge. </li><li> Machen Sie einen kleinen horizontalen Schnitt in der Luftröhre 1-2 Ringe unterhalb des Kehlkopfes mit abgewinkelten Scheren (45-90 º Winkel, scharf / scharf). Der Schnitt sollte groß genug sein, um sicher zu befestigen die Kanüle sein. </li><li> Legen Sie die Kanüle, so dass das verjüngte Ende erstreckt 03.02 Trachealringe unter dem Schnitt und sichern Sie die Kanüle an Ort und Stelle mit einem Seidenfaden. Sicherzustellen, daß das Nahtmaterial läuft zwischen der Luftröhre und der Speiseröhre und wird fest an der Kanüle gezogen wird. </li><li> Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit 1 ml Hanks Salzlösung (HBSS) und schieben Sie dessen Dorn in die Kanüle. </li><li> Mit einem langsam, aber ständig in Bewegung, injizieren ~ 900 ul in die Luftröhre, das Aufblasen der Lunge, und sofort zurückziehen HBSS. Legen Sie die wieder BALF in einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Wiederholen Sie diesen Lavage 2 weitere Male auf ca. 3 ml BALF für zukünftige Analysen zu sammeln. Bewahren Sie die BALF auf Eis oder bei 4 º C bis zur Verwendung. </li></ol><ol><li> Legen Sie eine 10-ml-Spritze in die Lunge Inflation Stand. Montieren Sie den Schlauch an den Luer, Luer auf den Hahn, und der Hahn an der Spritze. Sicherstellen, dass der Hahn in der geschlossenen Position. Die 10-ml-Spritze wird als Schwerkraftreservoir dienen. Der Behälter sollte auf die Inflation angebracht werden stehen in 4,75 über das Tier und die Oberseite des Behälters sollte in 10,5 über das Tier zu verlängern. </li><li> Füllen Sie die Spritze mit neutral gepufferten Formalin-Lösung. Sicherzustellen, dass die Spritze vollständig mit der Fixierlösung gefüllt. </li><li> Platzieren Sie ein saugfähiges Tuch unter dem offenen Ende des Rohres, und öffnen Sie den Wasserhahn, damit das Fixiermittel, um den Schlauch zu füllen. Sobald das Fixiermittel beginnt aus dem Schlauch fließt, sofort den Absperrhahn schließen und füllen Sie die Spritze an die Spitze mit Fixiermittel. Es ist wichtig, dass die Spritze vollständig gefüllt werden, um die geeignete Menge für Lungeninflationsdruck bereitzustellen. </li><li&gt; Geben vorsichtig ein zweites Stück Faden unter der Luftröhre, etwa 1-2 Trachealringe unter dem Ende der Kanüle. </li><li> Binden Sie einen einzigen lockeren Knoten in der Naht; jedoch nicht ziehen die Knoten fest. </li><li> Stecken Sie den Schlauch von der Maus Inflation stehen in die Kanüle. </li><li> Öffnen Sie den Wasserhahn und lassen die Lunge durch die Schwerkraft der Inflation zu füllen. </li><li> Sobald die Lunge erreichen ihre maximale Inflationsniveau, ziehen Sie den Faden fest und binden einen zweiten Knoten. </li><li> Schließen Sie den Wasserhahn und den Schlauch von der Kanüle entfernen. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Kanüle aus der Luftröhre durch Ergreifen der Naht mit einer Pinzette und Halten der Kanüle mit den Fingern. Ziehen Sie den Faden nach unten zum Brusthöhle und der Kanüle zurück in Richtung der Maus die Nase. </li><li> Fassen Sie die Luftröhre oder die Nähte mit einer Pinzette und heben die Luftröhre vom Hals Höhle. </li><li> Sever die Luftröhre kaudal der Naht verbunden mit einer stumpfen Schere. </li><li> Sobald die Tracheein frei ist von den darunter liegenden Geweben, beginnen die Luftröhre von der Maus ziehen. Vorsichtig heben die Lunge aus der Brusthöhle. </li><li> Schneiden Sie vorsichtig das Bindegewebe hält die Lungen in der Brusthöhle. Weiter zieht die Luftröhre vom Körper des Maus und gelten stetige Aufwärtskraft beim Schneiden die zugrunde liegenden Verbindungen. Achten Sie darauf, um zu vermeiden, schneiden die Lunge. Man beachte, dass die linke Herz sollte in die Lungen unter Verwendung dieses Verfahrens angebracht werden. </li><li> Sobald die Lunge entfernt worden sind, legen Sie sie in 10 ml Formalin. </li><li> Entfernen Sie einen Teil der Schwanz der Maus für die Genotypisierung. </li><li> Entsorgen Sie die Maus Karkasse nach den geeigneten institutionellen Richtlinien. </li></ol> 4. Zytokin-Bewertung <ol><li> Zentrifugieren Sie die Vollblut, unter Schritt 2.5 gesammelt, bei 12.000 xg für 5 min um das Serum zu isolieren. Das Serum in einer vormarkiert 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C </li><li> Bewerten Sie die serum Cytokinspiegel durch ELISA oder einem ähnlichen Test. Verdünnte Serum von 1.05 bis 1.20 in einer geeigneten Verdünnungspuffer je nach Assay nach den Anweisungen des Herstellers. Diese Verdünnungen sollten empirisch vor dem Ausführen der Großteil der Proben bestimmt werden. </li><li> Aufgrund des geringen Volumens der Serum gewonnen Verringerung des Probenvolumens auf die ELISA-Platte mit Halb geladen. Zum Beispiel verwenden die meisten kommerziellen ELISAs 100 ul-Volumina von Standards und Proben. Um Proben, Last 50 ul von Standards und verdünnten Serum sparen pro Vertiefung. </li><li> Zentrifuge der BALF in einem gekühlten Tischzentrifuge bei 200 g für 5 min. Übertragen Sie die zellfreie Überstand in zwei vormarkiert 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C </li><li> Bewerten BALF Zytokinen durch ELISA oder einem ähnlichen Test ohne Verdünnung. </li><li> Nicht verwendete Serum und BALF bei -80 ° C </li></ol> 5. Differentielle Färbung und BAL Zellularität Bewertung <ol><li> Nach BALF Zentrifugation und vollständige Entfernung HBSS, die Lyse pelletiert roten Blutkörperchen mit hypotonischen Kochsalzlösung. Resuspendieren der Zellen in 900 ul destilliertem Wasser. Sofort im 100 ul von 10x PBS. </li><li> Individuell Lyse jede Probe. Wenn Proben enthalten große Mengen an roten Blutzellen können die Zellen in der Tischzentrifuge bei 400 g für 5 min, und die Lyse der roten Blutkörperchen Protokoll kann wiederholt werden pelletiert werden. </li><li> Bestimmen Sie die Gesamtzellzahl in der BALF 1 ml Suspension mit einer Hämazytometer unter 10X oder 20-facher Vergrößerung mit Trypan-Blau-Färbung. Bewerten und präsentieren diese Daten als Zellen / ml. </li><li> Bereiten Materialien für die Zytospin und Differenz Färbung. Beschriften Sie Standardobjektträger mit einem Bleistift oder lösungsmittelbeständig Stift. Sichern Sie sich die Folien in eine Zytospin Halterung und Trichter. Befestigen Sie die Schieberanordnung in der Zytospin Rotors. </li><li> Cytospin 150 ul BALF bei 100 × g für 5 min. Wenn die Zelldichte zu groß ist, um effektivbewerten Zellmorphologie, reduzieren Sie die Lautstärke nach unten auf den Folien gesponnen. Die Objektträger über Nacht trocknen Luft. </li><li> Differential färben die Folien produziert nach den Protokollen. Die Objektträger über Nacht trocknen Luft. Deckglas die Folien mit Permount und bewerten die Objektträger unter dem Mikroskop mit 20X und 40X-Objektiv ausgestattet. </li><li> Ernte der verbleibenden Zellen für eine nachfolgende Analyse, wie FACS, Elektronenmikroskopie, konfokale Mikroskopie, die RNA-Extraktion zur Genexpression Auswertung und / oder Proteinextraktion für Western Blot. </li></ol> 6. Histopathologie Bewertung <ol><li> Bereiten Sie die Lunge für die Histopathologie Auswertung. Nach 24-48 h Formalin-Fixierung, ventral orientieren die ganzen aufgeblasenen Lungen und in Paraffin eingebettet. Schneiden Sie die Blöcke, um die daraus resultierenden Hauptstromatemwege freizulegen. </li><li> Um die Genauigkeit zu verbessern Scoring, positionieren die Lunge in der gleichen Position und trimmen jeden Block, die maximale Längs Visualisierung von t ergebener Intrapulmonale axialen Hauptatemwege. Von diesem Punkt schneiden 5 Mikron Serienschnitte und Fleck mit Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E). Zusätzliche Abschnitte geschnitten und in-situ-Hybridisierung unter Verwendung von Standard-Protokollen vorbereitet werden. </li><li> Auswerten Histopathologie unter Verwendung eines semi-quantitativen Bewertungssystem auf der Basis der folgenden Entzündungsparameter, der zwischen 0 (fehlt) und 3 (schwere) erzielt werden: einkernige und polymorphkernige Zellinfiltration; Atemwegsepithelzellen Zell-Hyperplasie und Verletzungen; Extravasation; perivaskuläre und peribroncheolar knuffen; und der Prozentsatz der Lunge mit Entzündung beteiligt. Lung Histopathologie sollte von einem erfahrenen Pathologen ausgewertet werden. </li><li> Durchschnittlich alle Parameterwerte, um eine Gesamt Histopathologie Wert zu generieren oder verwenden Einzelwertungen für die spezifische Aspekte der Krankheitsprogression zu quantifizieren. Führen Sie alle Scoring in einer doppelblinden Mode, mit Rezensenten sowohl Genotyp und Behandlung geblendet. Das Scoring-System wurde previously beschrieben 6,7,10. </li></ol>

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Biol. 44, 725-738 (2011).</li><li>Egger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+bleomycin+via+the+oropharyngeal+aspiration+route+leads+to+sustained+lung+fibrosis+in+mice+and+rats+as+quantified+by+UTE-MRI+and+histology.">Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Rayamajhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsurgical+intratracheal+instillation+of+mice+with+analysis+of+lungs+and+lung+draining+lymph+nodes+by+flow+cytometry.">Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Revelli, D. 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Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Bewertung der Immunantwort in der Maus Lunge ist wie folgt: 1) wählen Sie die entsprechende Maus-Stamm und Geschlecht für das Modell evaluiert; 2) Optimierung PAMP Lieferung in die Lunge; 3) richtig sammeln und verarbeiten die BALF; und 4) richtig fix und bereiten der Lunge für eine histopathologische Einschätzungen. Die Auswahl des Maus-Stamm ist ein wichtiger Faktor bei der Bewertung der Immunantwort. C57BL / 6 Mäuse sind in der Regel als...

Pulmonale Infektionen mit pathogenen Bakterienspezies verbunden sind, sind eine häufige Ursache von Morbidität und Mortalität weltweit. Die Bestimmung der Mechanismen, die die Immunantwort auf diese Krankheitserreger treiben die Entwicklung von neuen Präventionsstrategien und Therapeutika, die die Auswirkungen dieser Infektionen dämpft fördern. Das übergeordnete Ziel des hier beschriebenen Protokolls ist es, den Anwender mit einer flexiblen Verfahren zu schaffen, zu bewerten, den Host angeborenen Immunantwort auf Krankheitserreger Infektion mit einem Erregermuster (PAMP) als Surrogat für die lebenden Bakterien. Die Mehrheit der früheren Studien, die die Host angeborenen Immunantwort auf Bakterien auf peritoneale Modelle aufgrund der relativen Leichtigkeit der Ausführung konzentriert. Während diese Modelle sind sehr nützlich und in bedeutende Fortschritte auf dem Gebiet der Wirt-Pathogen-Interaktionen und systemischen Entzündung geführt hat, sind die aus diesen Modellen generierten Daten nicht immer für die entsprechenden Studien involving der Atemwege. Dabei wird ein Modell der akuten Lungenlungenentzündung als praktische und klinisch relevante Ausdehnung der klassischen intraperitoneale (ip) Injektion Modelle vorgeschlagen. Die vorgeschlagene Technik ermöglicht die lokale Bewertung der angeborenen Immunantwort bei einem organspezifischen Modellsystem. Die hier beschriebenen Verfahren sind für eine einfache und robuste Technik, um Benutzern, die Immunantwort des Wirts auf LPS, die eine gemeinsame PAMP ist, beurteilen zu können. Die Methoden basieren auf intratracheale (IT) Instillation von LPS, die eine robuste angeborene Immunantwort in den Lungen von Mäusen und ahmt viele der in menschlichen Patienten, die an Infektionen der Atemwege und akuter Lungenverletzung 1 beobachtet pathophysiologische Funktionen induziert basiert. Ein Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es dem Benutzer, den Host-Immunantwort ohne die Störfaktoren und Sicherheitsbedenken bei der Durchführung in vivo Studien verbunden zu bewertenmit lebenden Bakterien. Auch die Mund-Rachen es Verwaltung Weg der Exposition in diesem Protokoll beschrieben ist, hat erhebliche Vorteile gegenüber anderen häufig verwendeten Techniken, einschließlich intranasale (in) Verwaltung und chirurgische es Verwaltung. Zum Beispiel ermöglicht es oropharyngealen Verabreichung relativ genaue Dosierung und Lungenablagerung im Vergleich zu in der Verwaltung, die in der Regel leidet erhöhte Variabilität Lung durch den Verlust von Mitteln in der Nasenhöhle und Nasennebenhöhlen 2-4. Die IT-Administration Route umgeht diese Hohlräume und ermöglicht den direkten Zugriff auf die Luftröhre und der Atemwege. Ebenso ist es die chirurgische Ansatz eine deutlich krankhaften Verabreichungsmethode und erfordert umfangreiche Ausbildung zu meistern. Die hier beschriebenen Protokolle umfassen auch eine Beschreibung der gemeinsamen Techniken und Surrogat-Marker verwendet, um Entzündung Progression zu bewerten und am Ende mit einem Protokoll beschreibt die richtigen Techniken für die Vorbereitung der lungs für die Histopathologie Einschätzungen. Diese Protokolle basieren auf der Minimierung der Anzahl der Mäuse durch Maximierung der von jedem einzelnen Tier gewonnenen Daten für jede Studie erforderlich konzentriert. Die beschriebenen Protokolle sind sehr flexibel und kann leicht geändert werden, um ein breites Spektrum und die damit verbundenen Schäden PAMPs molekulare Muster (gedämpft) zu beurteilen. Außerdem mit ein paar zusätzliche Modifikationen, diese Protokolle auch auf Studien, die allergischen Atemwegskrankheitsprogression oder Wirt-Pathogen-Interaktionen mit lebenden Bakterien, Viren oder Pilzen 5-10 angewendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:269px;">C57Bl/6J</td>
			<td style="width:181px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:147px;">Stock 000664</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:269px;">Compact Scale</td>
			<td style="width:181px;">Ohaus Scale Corporation</td>
			<td style="width:147px;">71142845</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Small Animal Rectal Thermometer</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">TH 5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Rectal Probe for Rodents</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">RET 3</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Ear Punch</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">EP-S 901</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4</td>
			<td style="width:181px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:147px;">LPS-EB</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">1x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:181px;">Baxter</td>
			<td style="width:147px;">40032609</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand</td>
			<td style="width:181px;">ICAP Manufacturing</td>
			<td style="width:147px;">n/a</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Rodent Intubation Stand</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">RIS 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors (blunt/sharp)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">13-806-2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps (straight)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-327-379</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">forceps (45&#186;, curved)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-275</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors (blunt/blunt)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Pipette (200 &#181;l Capacity)</td>
			<td style="width:181px;">Gilson</td>
			<td style="width:147px;">F123601</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Ethanol</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">459844</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">&#160;1 ml Syringe</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">301025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">10 ml Syringe</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">301604</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">27 G x 0.5 in. needle</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">305109</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Refrigerated Microcentrifuge</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">13-100-676</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">732836</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">14025-076</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">4-0 Silk Braided Surgical Suture</td>
			<td style="width:181px;">Ethicon</td>
			<td style="width:147px;">A183</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Luer to Tube Connector Kits</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">721406</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Luer Stopcock Kit</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">721664</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Tygon formula E-3603 laboratory tubing</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">R-3603</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">HT501128-4L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse IL-1&#946; OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">559603</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">550950</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse TNF-&#945; OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">560478</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:181px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:147px;">3520</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hemacytometer Cover Glasses</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">22-021-801&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SV3008401</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytology Funel Clips</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-357</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytology Funels</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-354</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter Cards</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-030-410</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">12-544-1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cover Glasses</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">12-540A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cytospin Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A78300003&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Diff Quick Staining Kit</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">47733150</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Permount Mounting Medium</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SP15-500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the utilization of oropharyngeal intratracheal pamp administration and bronchoalveolar lavage to evaluate the host immune response in mice

Die Immunantwort auf Pathogene ist ein komplexer biologischer Vorgang. Die Mehrheit der in-vivo-Studien eingesetzt, um klassisch zu charakterisieren Wirt-Pathogen-Interaktionen nutzen intraperitoneale Injektionen von ausgewählten Bakterien oder Erreger associated molecular patterns (PAMPs) bei Mäusen. Während diese Techniken haben enorme Daten mit Infektionskrankheiten assoziiert Pathobiologie ergab, sind intraperitoneale Injektion Modelle nicht immer für Wirt-Pathogen-Interaktionsstudien in der Lunge geeignet. Mit Hilfe einer akuten Lungenentzündungsmodell bei Mäusen, ist es möglich, eine hochauflösende Analyse der Host angeborenen Immunantwort Verwendung Lipopolysaccharide (LPS) durchzuführen. Hier beschreiben wir die Methoden, um LPS verwalten mit nicht-chirurgischen oropharyngeal intratracheale Verwaltung, Überwachung klinischer Parameter mit der Krankheitsentstehung verbunden sind, und nutzen bronchoalveolären Lavage, um die Immunantwort zu beurteilen. Die Techniken, die beschrieben werden,sind weit für das Studium der Wirt angeborenen Immunantwort auf ein breites Spektrum von PAMPs und Pathogene. Ebenso können mit kleineren Modifikationen dieser Techniken können auch in Studien, die allergische Entzündung der Atemwege und in pharmakologischen Anwendungen eingesetzt werden.

Die Zellwände von Gram-negativen Bakterien von LPS, die sehr reichlich in der Umgebung besteht. Inhalation von LPS in sensiblen menschlichen Populationen verschlimmert Atemwegs-Reaktivität und kann zur Auslösung einer Immun response11 robust. LPS ist auch eine gemeinsame PAMP im Mausmodell verwendet, um eine robuste angeborene Immunantwort hervorzurufen. In der hier beschriebenen Protokoll erhielten die Mäuse eine Dosis von LPS es isoliert aus E. coli (Serotyp 0111: B4) mit oropharyngealen es Verwaltung. Be...

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The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

Die Immunantwort des Wirts auf Pathogen-Infektion ist eine streng reguliert Prozess. Mit Hilfe eines Lipopolysaccharid Lungenexpositionsmodell in Mäusen, ist es möglich, hochauflösende Auswertungen der komplexen Mechanismen der Krankheitsentstehung verbunden durch.

Die Nutzung der Oropharyngeale Intratracheale PAMP Verwaltung und bronchoalveoläre Lavage, um die Immunantwort in Mäusen Bewerten

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

the-utilization-oropharyngeal-intratracheal-pamp-administration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.5K Aufrufe.  Virginia Polytechnic Institute and State University.  Die Immunantwort des Wirts auf Pathogen-Infektion ist eine streng reguliert Prozess. Mit Hilfe eines Lipopolysaccharid Lungenexpositionsmodell in Mäusen, ist es möglich, hochauflösende Auswertungen der komplexen Mechanismen der Krankheitsentstehung verbunden durch. 

Serie: The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Mess-bakterielle Belastung und Immunreaktionen in Mäuse Infizierte mit Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Eine Einführung in die parasitischen Wespen<em&gt; Drosophila</em&gt; Und die antiparasitäre Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Quantitative Messung der Immunantwort und Sleep in<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

Die Quantifizierung der Atem Burst Antwort als Indikator für Angeborene Immunsystem Gesundheit in Zebrafisch

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Mit RNA-Interferenz, um die angeborene Immunantwort in Makrophagen der Maus Untersuchen

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

In-vitro-Analyse Myd88-vermittelte zelluläre Immunantwort gegen das West-Nil-Virus-Infektion Mutantenstamm

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

Die protektive Wirksamkeit und pulmonale Immunantwort nach subkutaner und intranasale BCG Verabreichung an Mäuse

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is based on the injection of non-pathogenic particles into insects, as the particles will be detected by the immune system and will induce the production of immune effectors. We focus here on the stimulation of the melanization response in the mosquito Anopheles gambiae. The melanization response results in the encapsulation of foreign particles and parasites with a dark layer of melanin. To stimulate this response, mosquitoes are inoculated with beads in the thoracic cavity using microcapillary glass tubes. Then, after 24 hr, the mosquitoes are dissected to retrieve the beads. The degree of melanization of the bead is measured using image analysis software. Beads do not have the pathogenic effects of parasites, or their capacity to evade or suppress the immune response. These injections are a way to measure immune efficacy and the impact of immune stimulations on other life history traits, such as fecundity or longevity. It is not exactly the same as directly studying host-parasite interactions, but it is an interesting tool to study immunity and its evolutionary ecology.

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

Impfen<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Mosquitoes mit Perlen der Melanisierung Immunantwort zu induzieren und Messen

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain insight into an ongoing disease state.
Here, a simple and efficient method is described to perform BAL on murine lungs without the need of special tools or equipment. BAL fluid is isolated by inserting a catheter in the trachea of terminally anesthetized mice, through which a saline solution is instilled into the bronchioles. The instilled fluid is gently retracted to maximize BAL fluid retrieval and to minimize shearing forces. This technique allows the viability, function, and structure of cells within the airways and BAL fluid to be preserved.
Numerous techniques may be applied to gain further understanding of the disease state of the lung. Here, a commonly used technique for the identification and enumeration of different types of immune cells is described, where&#160;flow cytometry is combined with a select panel of fluorescently labeled cell surface-specific markers. The BAL procedure presented here can also be used to analyze infectious agents, fluid constituents, or inhaled particles within murine lungs.

The health status of the lung is reflected by the type and number of immune cells that are present in the bronchioles of the lung. We describe a bronchoalveolar lavage technique that allows the isolation and study of nonadherent cells and soluble factors from the lower respiratory tract of mice.

Bronchoalveoläre Lavage von murinen Lungen zur Analyse der entzündlichen Zellinfiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during physiological and pathological states. The isolation of EVs continues to be a major challenge in this field, due to limitations intrinsic to each technique. The differential ultracentrifugation with density gradient centrifugation method is a commonly used approach and is considered to be the gold standard procedure for EV isolation. However, this procedure is time-consuming, labor-intensive, and generally results in low scalability, which may not be suitable for small-volume samples such as bronchoalveolar lavage fluid. We demonstrate that an ultrafiltration centrifugation isolation method is simple and time- and labor-efficient yet provides a high recovery yield and purity. We propose that this isolation method could be an alternative approach that is suitable for EV isolation, particularly for small-volume biological specimens.

Here, we describe two extracellular vesicle isolation protocols, ultrafiltration centrifugation and ultracentrifugation with density gradient centrifugation, to isolate extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid samples. The extracellular vesicles derived from murine bronchoalveolar lavage fluid by both methods are quantified and characterized.