Einer der Hauptvorteile dieser Technik zur Charakterisierung von Membrantransportern ist, dass Sie die relative Affinität des Transporters für bestimmte Substrate bestimmen und Einblicke in den Transportmechanismus gewinnen können. Die Charakterisierung von Membranproteinen, die Proteingradienten zur Anfahrt zum Substrattransport verwenden, eignet sich besonders für diesen inside-out Vesikel-Assay, den wir hier demonstrieren. Während dieser Test einige spezielle Geräte wie eine französische Presse und den Zugang zu einer Ultrazentrifuge erfordert, denken wir, dass es technisch einfacher sein kann als Assays, die erfordern, dass Membrantransporter zu künstlichen Liposomen rekonstituiert werden.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, die relativen Affinitäten für verschiedene Substrate zu quantifizieren und Wettbewerbstests durchzuführen, um die Wirkung konkurrierender Substrate auf Transportroste zu testen. Im Fall des BAT1-Transporters, der zur Veranschaulichung dieses Assays verwendet wurde, konnten wir auch die Substrataktivierung des Transporters durch Arginin nachweisen. Um dieses Verfahren zu beginnen, kulturieren Sie die vorbereiteten E.coli-Mutantenzellen, die das Zielprotein ausdrücken, indem sie eine einzelne Kolonie in fünf Milliliter Polyamin-3-Medien mit geeigneten Antibiotika impfen und es über Nacht bei 37 Grad Celsius anbauen.
Am nächsten Tag, übertragen Sie diese Kultur auf 500 Milliliter frische Polyamin 3 Medien, die mit 0.0002%arabinose ergänzt wird und wachsen, bis die Zellkultur erreicht eine OD600 zwischen 0.6 und 0.8. Danach zentrifugieren Sie bei 2000 mal G und bei vier Grad Celsius für 15 Minuten, um das Zellpellet zu sammeln. Das Pellet wieder aufhängen und dreimal mit Puffer eins durch Zentrifugieren bei 2000 mal G und bei jeweils 15 Minuten bei vier Grad Celsius waschen.
Das endgültige Volumen der Zellen in Puffer eins nach der dritten Drehung sollte 10 Milliliter betragen. Legen Sie eine 35 Milliliter französische Druckzelle und gießen Sie die Zellsuspension in den Körper der Zelle. Schalten Sie die Maschine mit dem Schalter am RHS auf der Rückseite des Geräts ein und stellen Sie den Ratio-Wahlschalter auf hoch.
Schalten Sie den Pumpenschalter ein. Der Kolben beginnt, von der Basis zu steigen, um die Luft in der Kammer zu verdrängen. Erhöhen Sie den Druck, indem Sie das Druckerhöhungsventil im Uhrzeigersinn drehen, bis das Messgerät 640 PSI erreicht.
Dadurch entsteht ein interner Druck von 10.000 PSI. Sobald die Zelle den Zieldruck erreicht hat, öffnen Sie die Durchflussventilbaugruppe leicht, indem Sie sie gegen den Uhrzeigersinn drehen. Stellen Sie die Öffnung des Ventils so ein, dass eine Durchflussrate von nur etwa 10 Tropfen pro Minute möglich ist.
Wenn die Stoppleitung am Kolbenkörper die Oberseite der Durchflusszelle erreicht, schaltet sich die Pumpe ab. Senken Sie die untere Platte, indem Sie den Ratio-Auswahlschalter nach unten platzieren, und dann den Pumpenschalter einschalten. Wenn die Bodenplatte vollständig eingefahren ist, reduzieren Sie den Systemdruck auf Null, indem Sie das Druckerhöhungsventil vollständig gegen den Uhrzeigersinn drehen.
Schalten Sie die Pumpe aus und schalten Sie die Maschine aus. Zentrifugieren Sie das französische Presseluant bei 10.000 mal G und bei vier Grad Celsius für 15 Minuten, um ungebrochene Zellen und Zellablagerungen zu entfernen. Entsorgen Sie das Pellet und übertragen Sie den Überstand in Ultrazentrifugenrohre.
Ultrazentrifugieren Sie den resultierenden Überstand bei 150.000 mal G und bei vier Grad Celsius für eine Stunde, um die Membranbläschen zu pellet. Waschen Sie die Membranbläschen einmal ohne Erneutsuspension in Puffer zwei. Verwenden Sie dann einen Dounce-Gewebeschleifer, um die Membranbläschen in Puffer zwei wieder aufzuhängen.
100 Mikroliter Der Membranpräparate in 1,5 Milliliter Zentrifugenrohren vorbereiten und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Waschen und suspendieren Sie zunächst die Vesikel in 30 Millimolar von Tris bei pH 7,8, das 0,1 Millimolar Kobalt-II-Chlorid enthält. Fügen Sie je 100 Mikroliter-Probe einen Mikroliter Carboxypeptidase A in Natriumchlorid, Tris und Kobalt-II-Chlorid hinzu.
20 Minuten bei 20 Grad Celsius inkubieren. Fügen Sie fünf Mikroliter einer Lösung, die Natrium-EDTA und 2-Mercaptoethanol bei PH 7.5 enthält, um die Verdauung zu stoppen. Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur für eine Stunde, um das Enzym vollständig zu inaktivieren.
Als nächstes zwischen fünf und 10 Mikroliter einer Lösung, die Lithium-Dodecylsulfat, Glycerin, Bromphenolblau und Tris bei pH 7,5 bis 100 Mikroliter der Probe enthält, und Proben mittels Elektrophorese analysieren. Zur Durchführung der Aminoblottinglegen Sie einen Nitrozellulosefilter mit 25 Millimolaren Natriumhydrogenphosphat auf das Polyacrylamid-Gel. Platzieren Sie diese zwischen zwei befeuchteten Zellulosefiltern und schließlich zwischen zwei befeuchteten Kunststoff-Scheuerpads.
Platzieren Sie diese Assemblage zwischen den Elektroden einer Kammer, die 25 Millimolar-Natriumhydrogenphosphat bei einer Temperatur zwischen zwei und vier Grad Celsius enthält. Elektrotransfer der Proteine bei 20 Volt und bei zwei bis drei Ampere für drei Stunden. Blockieren Sie die Nitrozellulosemembran im Sperrpuffer über Nacht bei zwei Grad Celsius.
Am nächsten Tag die Nitrocellulose bei 20 Millilitern einer bis 5 000 Verdünnung des Anti-His C-Terminal HRP Antikörpers und Blockierpuffers für zwei Stunden inkubieren und zweimal mit 50 Milliliter Puffer für insgesamt 60 Minuten waschen. Um den Aminofleck zu visualisieren, lösen Sie sechs Milligramm 4-Chlor-1-Naphthol in 20 Milliliter denaturiertem Alkohol auf und fügen Sie 80 Milliliter 15 Millimolar Tris und 50 Mikroliter 30% Wasserstoffperoxid hinzu. Das Filterpapier in dieser Substratlösung 20 Minuten lang aufstellen.
Wenn sich genügend Farbe entwickelt hat, spülen Sie die Membran mit Wasser ab und lassen Sie sie trocknen. Um zu beginnen, inkubieren Sie die 100 Mikroliter Aliquot der MembranVesikbei bei 12 Grad Celsius für fünf Minuten. Fügen Sie Puffer 3, der radioaktiv markierte Polyamine in einer Endkonzentration von 50 Mikromolaren enthält, in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren in die Membranbläschen ein, um den Transport zu initiieren.
Führen Sie den Transport-Assay bei 12 Grad Celsius für eine Minute. Danach die Reaktionsgemische auf den Filtrationskrümmer übertragen und durch einen 0,45 Mikrometer Nitrocellulose-Membranfilter filtern. Fügen Sie drei Milliliter eiskalten Assaypuffer mit einer zehnfach höheren Konzentration von nicht beschrifteten Polyamonien hinzu, gefolgt von drei Millilitern Assaypuffer ohne die Polyame, um die unspezifische Bindung zu reduzieren.
Übertragen Sie die gewaschenen Filter auf 20 Milliliter Einweg-Szintillationsfläschchen mit 10 MilliliterSzlotationsflüssigkeit und verwenden Sie einen flüssigen Szintillationszähler, um die Radioaktivität zu bestimmen. Berechnen Sie die Netto-Polyaminaufnahme, wie im Textprotokoll beschrieben. Bestimmen Sie den Km für das Substrat, indem Sie die Aufnahme von radioaktiv markiertem Substrat in Vesikel messen, die das Zielprotein exemiten, und berechnen Sie die Michaelis-Menten-Kinetik mit einer nichtlinearen Regressionsmethode.
Für die Wettbewerbsexperimente fügen Sie das nicht gekennzeichnete Wettbewerbssubstrat, das im Assaypuffer hergestellt wird, dem Zentrifugenrohr hinzu, das 100 Mikroliter Vesikel bei 12 Grad Celsius enthält, während gleichzeitig 50 Mikromolar des radioaktiv markierten Polyamins hinzugefügt werden. Messen Sie die Radioaktivität, die in Denbeinen gefangen ist, wie zuvor beschrieben. Bestimmen Sie ein übergeordnetes KM für die wettbewerbsorientierten Substrate, indem Sie die Aufnahme von radioaktiv markierten Polyaminen und das Vorhandensein von 100 mikromolaren oder höheren nicht-labelierten Substraten messen und eine nichtlineare Regressionsmethode verwenden, um die Kurve darzustellen.
In dieser Studie wird ein Anti-Porter dadurch charakterisiert, dass er zuerst das Protein in E.coli exprimiert und dann Membranbläschen erzeugt, so dass das heterologös exprimierte Protein in einem zellfreien System untersucht werden kann. Ein westlicher Fleck wird verwendet, um zu überprüfen, ob AtBAT1 in Vesikel umgesiedelt ist. Die Untersuchung des Blots mit einem Anti-His C-terminalen Antikörper ergab ein Fusionskonstruktprotein, das etwa 72,3 Kilodaltonen beträgt.
Die Verdauung der Vesikel vor SDS-PAGE führte zu einer Verminderung, aber nicht zu einem vollständigen Verlust des Sondensignals. Bei 12 Grad Celsius ist die Aufnahme eines radioaktiv markierten Spermidins durch die Vesikel mit einer Minute am höchsten und blieb über drei Minuten linear. Daher wird die Inkubationszeit für den Transporttest auf eine Minute festgelegt.
Nach einer Minute gibt es keine Nettoaufnahme von Isotopen durch Membranvesik, die bei pH 8,0 hergestellt und gespeichert wurden, da es keinen Protonengradienten über der Vesikelmembran gibt. Um die Wirkung der Ableitung des künstlichen Protonengradienten zu demonstrieren, werden die Membranbläschen 10 Minuten lang im pH 8,0-Puffer inkubiert, bevor das markierte Substrat zugesetzt wird, was zu einer minimalen Aufnahme von radioaktiv markiertem Substrat führt. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Protonen-getriebene Aufnahme von Spermidin auf das BAT1-Protein zurückzuführen ist.
Um die Substratspezifität des Proteins zu bestimmen, werden km-Werte berechnet, indem die Aufnahme von radioaktiv markiertem Substrat in verschiedenen Konzentrationen gemessen wird. Die Km-Werte für Spermidin, Putrescin und Arginin deuten darauf hin, dass es sich bei diesem Protein um einen hochaffinen Polyamin- und Argininaustauscher handelt. Die Affinität des Transporters für ein bestimmtes Substrat kann auch indirekt durch Wettbewerbstests bestimmt werden.
Diese Assays zeigen, dass GABA ein wettbewerbsfähiger Inhibitor von Spermidin ist. Darüber hinaus zeigt die Messung der Aufnahme von 50 Mikromolaren von radioaktiv markiertem Spermidin in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen verschiedener Aminosäuren, dass AtBAT1 auch in der Lage ist, Glutamat und Alanin in Millimolarkonzentrationen zu transportieren. Bei diesem Verfahren ist die Integration des Membrantransporters in die bakterielle Membran natürlich kritisch.
Die Überprüfung, ob das Protein von Interesse in die Membran integriert ist, kann mit Antikörpern durchgeführt werden, die gegen die C-Terminal-Tags gerichtet sind. Genetische Variation von menschlichen Transportern kann den Transport von, sowohl Metaboliten und Medikamente, die Substrate des jeweiligen Transporters sind beeinflussen. So kann allel Variation beeinflussen, sowohl, Aufnahme und Ausscheidung von Medikamenten.
Viele allelische Varianten lassen sich durch seitlichgesteuerte Mutagenese des Transportergens in einem Expressionsvektor schnell machen. Funktionelle Assays dieser Varianten können dann unter sehr kontrollierten Bedingungen mit Inside-Out-Vesikel-Assays getestet werden. Membrantransporter machen acht bis zehn aller Proteine aus, und die Mehrheit wurde in keinem der Modellorganismen vollständig charakterisiert.
Transporter, die auf Organellenmembranen lokalisiert sind, sind besonders schwierig, durch heterologe Expression in eukaryotischen Zellen zu charakterisieren. Können Austauschtyp- oder Protonentransporter auf diese E.coli-Membran lokalisiert werden, können diese Transporter mit diesem In-vitro-Assay funktionell charakterisiert werden. Die Qualität und Ausbeute der Vesikel wird durch die Rate der Elution von Zellfragmenten aus der französischen Presse beeinflusst.
Bei der Transportuntersuchung von Vesikeln mit Isotopen ist es wichtig, einen experimentellen Aufbau zu haben, der experimentelle Replikationen erleichtert. Es gibt viele Möglichkeiten, dies zu tun, aber wir denken, dass es hilfreich für uns sein wird, Ihnen zu zeigen, wie wir es getan haben.
