In diesem Video beschreiben wir eine Modellstudie für den Mechanismus der Amyloid-Toxizität auf Membranebene unter Verwendung von Rattenhirnmitochondrien als in vitro biologisches Modell. Trotz des akkumulierenden Berichts, der den Mechanismus der Membranstörungen durch Amyloid-Aggregat in Phospholipid-Modellsystemen beschreibt, die direkt auf die Ereignisse abzielen, die bei der Entwicklung der biologischen Membran beginnen. Im vorliegenden Video beschreiben wir Amyloidfibrillen von Alpha-Synuclein, die die Mitochondrienmembran des Rattengehirns als in vitro biologisches Modell analysieren.

Wir glauben, dass Mitochondrien als Organelle mit gut charakterisierten Membranen ein äußerst nützliches biologisches Modellsystem für molekulare Studien im Zusammenhang mit dem Mechanismus der Amyloidzytotoxizität auf Membranebene im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen bieten können. Enthaupten Sie die Ratte mit einer kleinen tierischen Guillotine und entfernen Sie das Gehirn von der Skala innerhalb einer Minute nach der Enthauptung der Ratte, um eine mögliche Verschlechterung der mitochondrialen Eigenschaften zu begrenzen. Es ist wichtig, schnell zu arbeiten und alles während des gesamten Verfahrens auf Eis zu halten.

Waschen Sie das Gewebe zweimal mit 30 Milliliter Isolationspuffer. Auf einen Becher mit Kalteisolationspuffer übertragen und das Gehirn mit einer Schere fein zerkleinern. Übertragen Sie die Gewebesuspension auf einen 20 Milliliter Kaltentun-Homogenisator.

Homogenisieren Sie die Gewebestücke mit neun Auf- und Abschlägen mit einem motorisierten Stößel. Lassen Sie die Mischung ca. 30 Sekunden nach jedem Satz von drei Homogenisierungsschlägen auf Eis, um sicherzustellen, dass das Homogenat kalt bleibt. Das Homogenat bei vier Grad Celsius drei Minuten in ein vorgekühltes Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 1, 300 G geben.

Den Überstand vorsichtig dekantieren und in ein vorgekühltes Zentrifugenrohr geben. Zentrifuge bei 21.000 G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem Dichtegradientenmedium wieder auf, indem Sie die Mischung vorsichtig mit der Pipette rühren.

Zentrifuge in einem festen Winkelrotor bei 30, 700 G bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie mit einer Pasteur-Pipette das scharfe Ende des oben angesammelten Materials, das meist Myelin enthält. Fügen Sie der mitochondrialen Fraktion einen Isolationspuffer von acht Millilitern hinzu, während Sie die Mischung vorsichtig mit der Pipette rühren.

Zentrifuge bei 16, 700 G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, so dass das untere lose Pellet ungestört bleibt. Fügen Sie einen Milliliter 10 Milligramm pro Milliliter fettsäurefreies BSA in das Zentrifugenrohr, während Sie die Mischung vorsichtig mit der Spitze der Pipette rühren.

Machen Sie das Volumen auf fünf Milliliter, indem Sie Isolationspuffer hinzufügen. Zentrifuge bei 6, 900 G bei vier Centigrade für 10 Minuten. Dadurch sollte ein festes Pellet entstehen.

Dekantieren Sie den Überstand und setzen Sie das mitochondriale Pellet im Isolationspuffer sanft wieder aus. Mitochondriales Homogenat auf ein Milligramm pro Milliliter mit Kälteisolationspuffer verdünnen und in zwei 1,5-Milliliter-Röhren, typischerweise 195 Mikroliter Mitochondrien pro Tube, geben. Fügen Sie fünf Mikroliter 20% Volumen pro Volumen Triton X-100 zu einem Rohr als positive Kontrolle für maximale Enzymaktivität und fünf Mikroliter entionisiertes Wasser zu einem anderen Rohr zur Kontrolle, gefolgt von dem Mischen mit einem Rührwerk.

Inkubieren Sie die Rohre für 10 Minuten in warmes Wasserbad auf 30 Centigrade eingestellt. Pellet mitochondrien durch Zentrifugieren von Rohren in einem festen Winkelrotor bei 16 000 G vier Grad Celsius für 15 Minuten. Sammeln Sie sorgfältig resultierende Überstandmittel zur Beurteilung der Aktivität der mitochondrialen Malatdehydrogenase mit einem standardspektrophotometrischen Assay, der im nächsten Teil beschrieben wird.

Berechnen Sie die Integrität der mitochondrialen Membran wie folgt. Zur Bestimmung der Malate-Dehydrogenase-Aktivität simpere Pipette 890 und 880 Mikroliter 50 Millimolar Tris-HCL Puffer zu leeren und Probe test Küvetten jeweils gefolgt von 100 Mikroliter 50 Millimolar Oxaloacetat und 10 Mikroliter 10 Millimolar Beta-NADH. Setzen Sie die Küvetten in ein Spektralphotometer und Referenz gegen Leerzeichen.

10 Mikroliter mitochondriales Homogenat ein Milligramm pro Milliliter zur Probeküvetette geben. Sofort durch Inversion mischen. Rekordabnahme der Absorption durch NADH-Oxidation bei 340 Nanometer für eine Minute.

Für Alpha-Synuclein-Amyloid-Fibrillation, fügen Sie 294 Mikroliter Proteinlösung, 200 Mikromolar zu jeder 1,5 Milliliter Tube. Dann fügen Sie sechs Mikroliter ThT-Lösung ein Millimolar. Mischen Sie die Lösungen und inkubieren Sie die Rohre in einem Thermomixer bei 37 Centigrade unter ständigem Rühren bei 800 U/min.

Für Rinder insulin amyloid Fibrillation, fügen Sie 637 Mikroliter Proteinlösung, 250 Mikromolar zu 1,5 Milliliter Tube. Dann fügen Sie 13 Mikroliter ThT-Lösung ein Millimolar gefolgt von Rühren. Fügen Sie aliquots 200 Mikroliter Proteinlösungen zu jedem Brunnen einer klaren unteren 96-Well-Platte hinzu.

Versiegeln Sie die Platte mit kristallklarem Dichtband. Laden Sie die Platte in Cytation 5 Fluoreszenzplattenleser. Messen Sie die ThT-Fluoreszenz im 30-Minuten-Takt für 12 Stunden.

Verwenden Sie Anregung bei 440 Nanometer und Emission bei 485 Nanometer. Wählen Sie die Brunnen aus. Schütteln Sie die Platte fünf Sekunden vor jeder Messung.

Stellen Sie die Temperatur ohne Rührung auf 57 Grad Celsius ein. Bereiten Sie zwei Reihen von 1,5 Milliliter-Röhren vor, die mitochondriale Homogenate enthalten, eine Serie für MDH-Freisetzungstest und eine andere für die mitochondriale ROS-Messung. Fügen Sie Aliquots von frischen oder amyloiden Fibrillen von Alpha-Synuclein, Rinderinsulin oder Hühnereiweißlysozym zu mitochondrialem Homogenat hinzu, gefolgt von sanfter Pipettierung.

Inkubieren Sie Röhren mit mitochondrialen Suspensionen für 30 Minuten in warmem Wasserbad auf 30 Grad Celsius eingestellt. Für den Exat-Dehydrogenase-Freisetzungstest werden zentrifugierte mitochondriale Homogenate bei 16.000 G für 15 Minuten inkubiert. Sammeln Sie sorgfältig resultierende Überstand für die Aussage der Aktivität der mitochondrialen MDH, wie auf Protokollabschnitt 4 beschrieben.

Berechnen Sie die Freigabe von MDH wie folgt. Für die mitochondriale ROS-Messung, Pipette 191 Mikroliter inkubiertes mitochondriales Homogenat zu jedem Brunnen einer 96-Well-Platte. Fügen Sie vier Mikroliter von 50 Mikromolar DCFDA.

Dann fünf Mikroliter 200 Millimolar Succinat hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte für 30 Minuten in warmem Wasserbad auf 30 Centigrade eingestellt unter sanftem Rühren. Laden Sie die Platte in einen Cytation 5 Fluoreszenzplattenleser und messen Sie die Fluoreszenzintensität gemäß dem Protokollabschnitt.

Die mitochondriale Membranintegrität wurde durch Messung der MDH-Aktivität in den isolierten Mitochondrien vor und nach Membranunterbrechung und Enzymfreisetzung durch Triton X-100 bewertet. Wie Sie sehen, haben wir in der Regel festgestellt, dass mitochondriale Präparate etwa 93% intakt sind. ThT Fluoreszenz-Assay wurde durchgeführt, um das Wachstum von Amyloidfibrillen zu überwachen.

Die Kurve für Amyloid-Fibrillation von drei Proteinen zeigte ein typisches sigmoidales Muster, das bei Alpha-Synuclein, Rinderinsulin und Hühnereiweißlysozym bis zu einem Plateau reichte, was auf die Bildung von Amyloidfibrillen hindeutet, die durch AFM-Messung mehr bestätigt wurden. Mögliche Permeabilisierung und Schädigung der mitochondrialen Membran durch Amyloidfibrillen wurde durch die Freisetzung von mitochondrialer MDH und mitochondrialer ROS-Messung untersucht. Wie Sie in der linken Grafik sehen, wurde eine wesentliche Freisetzung von MDH bei Zugabe der Alpha-Synuclein-Amyloidfibrillen zu Mitochondrien beobachtet.

Während eine leichte Freisetzung durch Insulinfibrillen festgestellt wurde, wurden Hühnerei-Weiß-Lysozyme-Fibrillen als unwirksam befunden. Rechte Grafik zeigt die Wirkung von Amyloidfibrillen auf den mitochondrialen ROS-Gehalt. Während keine signifikante Verbesserung der mitochondrialen ROS wurde bei Zugabe von Hühnerei Weiß Lysozym oder Insulin Amyloid Fibrillen beobachtet, Behandlung mit Alpha-Synuclein Fibrillen führte zu einem erheblichen Anstieg des ROS-Gehalts des Gehirns Mitochondrien.

Das vorliegende Video beschreibt eine Modellstudie für den Mechanismus der Fibel-Aggregatzytotoxizität auf Membranebene und zeigt, wie Amyloidfibrillen, die aus verschiedenen Proteinen entstehen, unterschiedliche Grade von Membranschäden und Permeabilisierung verursachen können. Während einige Themen der Amyloidfibrillen und ihre spezifische Bindungsmembran scheinen mit der Fähigkeit zu interagieren und verursachen Destabilisierung und nachfolgende Störungen der Membranen. Nach diesem Video werden Sie in der Lage sein, die Wechselwirkung von nativer Form, Präfibrillar und reifen Amyloidfibrillen verschiedener Peptide und mit Mitochondrien aus verschiedenen Geweben oder verschiedenen Bereichen des Gehirns isoliert zu untersuchen.