Heute möchten wir Ihnen Varianten des gemeinsamen wärmeinduzierten Antigen-Retrieval-Protokolls zeigen. Es kombiniert die Vorteile der niedrigeren Temperatur für das neutrophile Elastase-Antigen und hohen pH-Wert, der für Histone erforderlich ist. Diese Technik ermöglicht es, NETs, neutrophile extrazelluläre Fallen, in Paraffingeweben sowohl von Maus als auch von Männern zu studieren.
Und es wird auch erwogen, archiviertes Material oder retrospektive Studie zu studieren. Legen Sie zunächst die vorbereiteten Dias in Regale und tauchen Sie sie für jeweils fünf Minuten in die Medien ein, die für Dehydrierung und Clearing verwendet werden. Als nächstes erhitzen Sie ein Wasserbad mit einer temperaturgeregelten Kochplatte auf 70 Grad Celsius.
Legen Sie ein Glas gefüllt mit wärmeinduzierten Epitop-Retrievalpuffer und 10%Glycerin in das Wasserbad. Wenn der Puffer 70 Grad Celsius erreicht hat, legen Sie das Rack mit den Dias in das Pufferglas. Inkubieren Sie die Rutschen bei 70 Grad Celsius für 120 Minuten.
Danach das Glas aus dem Wasserbad nehmen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Spülen Sie die gekühlten Abschnitte dreimal mit dem ionisierten Wasser und einmal mit TBS. Mit gewalztem Filterpapier oder einem Wattestäbchen entfernen Sie vorsichtig jede Flüssigkeit zwischen den Abschnitten auf den Dias, wobei Sie sicherstellen, dass die Abschnitte hydratisiert bleiben.
Verwenden Sie dann einen hydrophoben Barrierestift, um eine Barriere um jeden Abschnitt zu schaffen. Inkubieren Sie den Abschnitt im Sperrpuffer bei Raumtemperatur 30 Minuten lang, um eine unspezifische Bindung zu verhindern. Verdünnen Sie die primären Antikörper im Sperrpuffer in einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter.
Entfernen Sie den Sperrpuffer aus den Folien, und fügen Sie die verdünnten primärantikörper hinzu, um ein ausreichendes Volumen zu verwenden, um eine Trocknung zu verhindern. Schließen Sie den feuchten Behälter und bebrüten Sie die Nacht bei Raumtemperatur. Am nächsten Tag die Abschnitte dreimal mit TBS waschen, wobei jede Wäsche fünf Minuten dauert.
Bereiten Sie eine funktionierende Lösung für sekundäre Antikörper im Blockierpuffer vor. Bedecken Sie die Gewebeabschnitte mit der sekundären Antikörperlösung, und übertragen Sie die Dias in einen feuchten Behälter. Versiegeln Sie den feuchten Behälter und brüten Sie bei Raumtemperatur für eine Stunde.
Danach die Abschnitte dreimal mit TBS und einmal in Wasser mit jeder Fünf-Minuten-Waschzeit waschen. Bedecken Sie die gewaschenen Abschnitte mit Montagemedium, und tragen Sie Deckelglas auf, während Blasenbildung vermieden wird. Nachdem sich das Montagemedium verfestigt hat, verwenden Sie ein konfokales Mikroskop oder ein Weitfeldmikroskop mit geeigneten Bandpassfiltern, um die Immunfluoreszenz zu analysieren.
Um die gesamten Abschnitte mit einem Diascanner zu digitalisieren, legen Sie die Fluoreszenzintensität mithilfe der negativen und positiven Steuerelemente fest. Mit der neutrophilen Elastase Färbung, finden Sie die neutrophilen-reichen Bereiche und zoomen Sie auf diese Bereiche zu überprüfen, ob das neutrophile Elastase-Signal granular oder extrazellular ist. Wenn das Signal extrazellulär ist und sich sowohl mit Histon- als auch mit DNA-Färbung überlappt, wurden die neutrophilen extrazellulären Fallen erhalten.
In dieser Studie werden NET-Komponenten erfolgreich in Paraffin-eingebettetem Gewebe nachgewiesen, sowohl von menschlicher als auch mit muriner Herkunft. Wenn die Gewebeabschnitte eine Dicke zwischen zwei und drei Mikrometern haben, können sie durch Weitfeldmikroskopie mit 10- oder 20-fachen Objektiven analysiert werden. Um die Färbung richtig einzuschätzen, wurden sowohl negative als auch positive Proben verarbeitet.
Ein repräsentativer Abschnitt des menschlichen Appendizitisgewebes zeigt Gewebe, das für NE, H2B und Hoechst 33342 gefärbt ist. Die Bilder auf der linken Seite stammen aus einem Bereich des Abschnitts, der NETs enthält, während die Bilder auf der rechten Seite aus einem anderen Bereich desselben Abschnitts stammen, der zahlreiche Neutrophile, aber keine NETs enthält. Bereiche mit massiver NET-Bildung sind auch bei geringer Vergrößerung leicht zu finden, da alle drei NET-Komponenten häufig in stringy extrazellulären Strukturen kolokalisiert sind.
Dies erscheint in der Überlagerung der drei Kanäle als weißliche extrazelluläre Fasern, die mit Hilfe von Bildanalyse-Software quantifiziert werden können, um ein violettes Overlay mit Pixeln aus überlappenden Signalen zu erstellen, die positiv für Grün, Rot und Blau sind. Für eine höhere Auflösung müssen konfokale Mikroskope oder Weitfeldmikroskope mit Dekonvolution verwendet werden, um unscharfe Unschärfen zu minimieren. Eine maximale Projektion eines konfokalen Stapels eines NET-reichen Bereichs aus derselben menschlichen Appendizitis-Probe zeigt, dass NE in Granulaten vorkommt, aber auch extrazellulär reichlich vorhanden ist, wo es mit H2B und mit DNA kolokalisiert wird.
Die extrazelluläre Kolokalisierung führt zu einer weißlichen Farbkombination. Die Pixel positiv für Grün, Rot und Blau können wieder verwendet werden, um ein violettes Overlay mit NETs zu erstellen. Ein repräsentatives Detail eines zentralen Abschnitts aus einer mit Mycobacterium tuberculosis infizierten Mauslunge liefert ein weiteres Beispiel dafür, dass die Kolokalisierung aller drei NET-Komponenten als weißliche Bereiche zwischen Neutrophilen deutlich sichtbar ist, die verwendet werden können, um eine violette Schicht zu erstellen, die NETs anzeigt.
Während des Färbevorgangs dürfen die Abschnitte nicht trocken fallen, da dies zu einer falsch-positiven Färbung oder einem hohen Hintergrund führt. Die Analyse von archiviertem Material kann helfen, die Auswirkungen von NE bei Krankheiten zu verstehen. Da Paraffingewebe einen riesigen Hintergrund haben kann, ist es wichtig, eine positive und eine negative Kontrolle zu haben, die Sie zwischen Ihrer Färbung und dem Hintergrund unterscheiden können.
Dewaxing und Dehydrierung sollten unter einer Dunstabzugshaube durchgeführt werden. Achten Sie darauf, Handschuhe und Ihren Labormantel zu tragen.
