Unser neues Protokoll ermöglicht es uns tatsächlich, zelluläre Strukturen in 3D mithilfe von Röntgen-Computertomographie zu visualisieren. Und wir tun dies, indem wir Gewebe mit Eosin färben und so das Zytoplasma sichtbar machen. Neben medizinischen Anwendungen und Forschung denken wir auch, dass unsere Methode in der Biologie angewendet werden kann, wie zum Beispiel in der Zoologieforschung oder der Entwicklungsbiologie.
Die Technik ist relativ unkompliziert, sehr schnell und auch für größere Gewebeproben geeignet. Wir denken, dass unser Ansatz in Kombination mit Röntgen-Mikro-Computertomographie in den klinischen Workflow integriert werden kann und dann Pathologen tatsächlich helfen kann, bessere Entscheidungen zu treffen. Beginnen Sie mit der Fixierung der Weichteilproben.
Füllen Sie ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr mit einer fixativen Lösung, die 9,5 Milliliter 4%Formaldehyd und 0,5 Milliliter Eisessigsäure enthält. Fügen Sie die Weichteilprobe in das Zentrifugenrohr und kühlen Sie sie für 24 bis 72 Stunden. Nach der Kühlung die Weichteilprobe mit DPBS-Lösung eine Stunde lang waschen.
Dann färben Sie die Probe, indem Sie sie in zwei Milliliter Eosin Y Färbung Lösung und inkubieren Sie es auf einer horizontalen Schüttelplatte für 24 Stunden. Am nächsten Tag die Weichteilprobe vorsichtig aus dem Probenbehälter nehmen und überschüssiges Färbemittel mit Zellulosegewebepapier entfernen. Legen Sie es in einen konischen Behälter über einer Ethanoldampfphase zur Lagerung und weiterverwendung.
Bereiten Sie einen geeigneten Probenhalter vor, um die Weichteilprobe gemäß den Anweisungen des Manuskripts zu montieren, und stellen Sie eine enge Passform sicher, um zu verhindern, dass sich die Probe während der Röntgen-CT-Messungen bewegt. Sobald der Klebstoff gehärtet ist und der Probenhalter einsatzbereit ist, übertragen Sie die Mausniere in das intakte Zentrifugenrohr, das ein paar Tropfen 70% Ethanol an der Unterseite hält. Legen Sie die montierte Probe in den Röntgen-CT-Scanner.
Nachdem Sie das Beispiel sorgfältig ausgerichtet haben, wählen Sie Erfassungsparameter für die beste Bildqualität aus. Für die vorgestellten Mikro-CT-Daten erfassen Sie den Scan bei einer Spitzenspannung von 50 Kilovolt und einem Strom von 3,5 Watt mit 1601 Projektionen, die gleichmäßig über 360 Grad verteilt sind. Verwenden Sie dann die Micro-CT-Daten aus dem Übersichtsscan, um den Interessenbereich für den hochauflösenden CT-Scan auszuwählen.
Bereiten Sie die Interessensmengen der Weichteilprobe vor, indem Sie sie mit einem Skalpell und einem Stereomikroskop in sehr kleine Stücke von etwa 0,5 Millimeter Kantenlänge schneiden. Wenn Sie eine Mausniere verwenden, schneiden Sie sie entlang der längsten Achse in zwei Hälften. Nehmen Sie die eine Hälfte und bereiten Sie verschiedene anatomische Regionen wie eine Nierenrinde und renale Medulla.
Die kleinen Stücke zur Austrocknung auf eine neue Petrischale übertragen. Dehydrieren Sie die Proben mit einer Reihe von Ethanol-Lösungen nach Manuskriptrichtungen, die jeden Dehydrierungsschritt für eine Stunde durchführen. Übertragen Sie die dehydrierten Proben in die mikroporöse Kapsel und schließen Sie sie.
Halten Sie die Proben jederzeit mit 100% Ethanol in Kontakt. Dann kritischen Punkt trocknen die kleinen Gewebestücke. Sobald die Gewebeproben vorbereitet sind, bewahren Sie sie vor der weiteren Verwendung in einer neuen Petrischale in einem Trockenhaus auf.
Montieren Sie die Gewebeteile an einem geeigneten Probenhalter, um eine enge Passform zu gewährleisten. Für eine Mausniere überkleben Sie die Stücke mit einem Stereomikroskop an einen Probenhalter. Wählen Sie nach sorgfältiger Ausrichtung der Probe Erfassungsparameter für die beste Bildqualität aus.
Für die vorgestellten Nano-CT-Daten erfassen Sie Projektionen mit einer Spitzenspannung von 60 Kilovolt mit 1599 Projektionen, die gleichmäßig über 360 Grad und eine Voxelgröße von etwa 400 Nanometern verteilt sind. Dieses Protokoll wurde zur 3D-Visualisierung mikroskopischer Gewebestrukturen einer Mausniere verwendet. Mikro-CT-Messungen mit niedriger Auflösung ermöglichten einen Überblick über das gesamte Organ und halfen, Interessensmengen für hochauflösende Messungen zu identifizieren.
Die gleiche Mausniere wurde verwendet, um eine hochauflösende Mikro-CT-Daten zu erhalten. Eine detailliertere Sicht auf die anatomischen Strukturen wie der Kortex, äußere Medulla und innere Medulla unter anderem erreicht. Ein Volumen von Interesse Rendering zeigt die Medulla-Region und einen virtuellen Abschnitt durch das Schiff.
Der Nano-CT wurde verwendet, um eine detaillierte Ansicht der Nierenprobe auf zellulärer Ebene zu erhalten. Ein kleines Stück Gewebe aus der ganzen Mausniere wurde verwendet, um die dick aufsteigenden Gliedmaßen der Schleife von Henle mit einer Voxelgröße von etwa 400 Nanometern abzubilden. Eine vergleichende Studie wurde durchgeführt, um sicherzustellen, dass der Nano-CT vollständig mit der Histopathologie kompatibel ist.
Der multimodale Bildgebungsansatz bestätigte die mit beiden Methoden erzielten Ergebnisse. Während des Inkubationsschritts ist es entscheidend, dass die Probe vollständig von der Färbelösung umgeben ist. Auch bei der Durchführung von CT-Röntgenaufnahmen ist es am wichtigsten, die Probenstabilität bei der Datenerfassung zu gewährleisten.
Die mit unserem Protokoll analysierten Weichteilproben können mit hilfe der standardhistologischen Technik wie der Gegenfärbung von Hämatoxylin weiter analysiert werden. Unser Färbeprotokoll wird wesentlich zur Weiterentwicklung der 3D-Röntgenhistologie beitragen. Die medizinische Forschung wird insbesondere von dieser zerstörungsfreien 3D-Bildgebungstechnik profitieren.
