Die Studien wurden an der Irving Moskowitz und Cherna Center for Nano-und Bio-Nano Imaging am Weizmann Institute of Science durchgeführt. Wir sind dankbar, Orna Yeger für ihre Hilfe bei der Gestaltung und Durchführung dieses Protokolls.

1. Probenvorbereitung <ol><li> Nach dem Entpacken des Gewebes, das untersucht werden soll, kann mineralisierten Geweben in das Instrument positioniert und abgebildet. Um das Bild mit der Maus Femur sollte man die folgenden Schritte: <ol><li> Entfernen post mortem Bein von einem C57/BL6 Embryo 18,5 Tage postceutus (E18.5). </li><li> Seal das schmale Ende einer Polystyrol-Pipettenspitze (20-200 ul) mit Epoxidharz oder einem anderen Kleber, und füllen Sie die Spitze mit dem Arbeitstitel Puffer (PBS oder andere). </li><li> Fit eng am Bein in die Spitze und Dichtung am anderen Ende mit Parafilm Blatt. </li><li> Setzen Sie die Pipettenspitze in einer geeigneten Halterung und folgen Sie dem Protokoll aus Kapitel 3. Zur Visualisierung der Oberschenkelknochen aus der Maus Bein Embryo, ist das Instrument 40 KV und 200 uA gesetzt. Für 8μ Auflösung 1000 Projektion von Bildern mit 4x Vergrößerung müssen erworben werden. </li></ol></li><li> Non-mineralisierten Geweben müssen zunächst fixiert und gefärbt, um die X-ray Abschwächung der Gewebe von Interesse, indem Sie eines der vielen verfügbaren Protokolle 8,9 zu erhöhen. Für die Rattenlungen und ähnliche Proben, ist die Vorbereitung Protokoll: <ol><li> Orthotopical Implantation von nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC) NCI-H460 auf nude Rattenlungen </li><li> Lungenkrebs Knötchen beginnen nachweisbar ist 4 Wochen nach der Implantation </li><li> Sacrifice der Ratte und sofort ziehen es mit Kochsalzlösung mit Heparin gemischt </li><li> Inject es mit einer verdünnten Lösung von Microfil (Flowtech), (2 ml der Verbindung Lösung, 3 ml Verdünnungsmittel und 0,3 ml Härter) in die linke Herzkammer, die bronchiale Zirkulation Fleck </li><li> Entpacken Sie die Lungen und das Herz der Ratte </li><li> Immobilisierung der Probe (siehe Kapitel 2 des Protokolls) durch den Einbau ihn fest in ein 50 ml Plastikröhrchen </li><li> Erstellen Sie einen gesättigten Ethanol Atmosphäre, indem Sie auf den Boden des Röhrchens ein Tuch in Ethanol gedämpft </li><li> Kleben oder schrauben das Rohr in einer Halterung des Instruments </li><li> Fahren Sie mit der Einstellung der Aufnahmeparameter (Kapitel 3). Für eine vollständige Darstellung der Rattenlungen der Quelle bei 40KV und 100 uA gesetzt. Um 16μ Auflösung zu erreichen hat man bis 2500 Projektionsbilder bei einer Vergrößerung von 0.5x zu erwerben. </li></ol></li></ol> 2. Beispiel Immobilisierung Bei hoher Auflösung, ist es wichtig, jede Veränderung in der Probe Position während der Messung zu vermeiden. Dazu wird die Probe fest in einem Kunststoff-Empfänger, dass seine Größe passt fixiert. Polystyrol Pipettenspitzen, Kunststoff Pasteur Pipetten oder eigens dafür gebauten Kunststoff-Halter sind in diesem Zusammenhang verwendet. Nach den experimentellen Anforderungen, kann die Probe in Luft untersucht werden oder eingetaucht in Ethanol oder Pufferlösungen. Typische Immobilisierung und endgültige Positionierung des Beines der Maus-Embryo in das Instrument ist in Abb. 1 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Endgültige Positionierung der embryonalen Maus Bein in der Mikro-CT Gerät. 3. Einstellen Aufnahmeparameter: x-ray von Spannung und Strom, CCD-Belichtungszeit <ol><li> Platziert in eine Halterung, wird die Probe in die Rotation der Bühne des Instrumentes gelegt </li><li> Ein erstes Röntgenbild wird mit der Spannung und Strom willkürlich genommen. </li><li> Wenn das Bild zu dunkel ist, sollte man die Anzahl der Photonen ersten Anstieg, so erhöht ein wenig den Strom. Ist dies nicht genug ist, sollte man leicht erhöhen die Energie der Röntgenphotonen, dh die Spannung an der Röntgenröhre. </li><li> Wenn das Bild zu hell ist, sollte man zuerst die Spannung zu verringern, wird der aktuelle. </li><li> Die Helligkeit des Bildes kann durch Binning erhöht werden. Binning von 1 berücksichtigt die Intensität der einzelnen Pixel des Bildes, während Binning von 2 nimmt die Summe der einzelnen Matrix von 2x2 Pixeln. Das Bild wird ca. 4 mal heller als im Fall von Binning 1, aber die Hälfte der Auflösung haben. </li><li> Nach der Einstellung der optimalen Helligkeit, muss man die Belichtungszeit der Kamera, um zwischen den besten Kontrast auf der einen Seite und einer angemessenen Dauer des Experiments auf der anderen Seite Kompromiss zu optimieren. </li><li> Der Kontrast der Bilder, vor allem der geringe absorbierende Proben können mit Hilfe von Filtern, die die Photonenfluss zu reduzieren, vor allem, dass der Photonen von niedrigerer Energie verbessert werden. </li></ol> 4. Probenpositionierung <ol><li> Wählen Sie die Arbeit Vergrößerung. Mögliche Optionen sind 0.5x, 4x, 10x, 20x und 40x. Das Sichtfeld nimmt mit zunehmender Vergrößerung. </li><li> Holen Sie sich die optimale Auflösung und Blickfeld, indem Sie die Abstände zwischen den Röntgenquelle und die Probe und zwischen der Probe und dem Detektor. Die Erhöhung der Quelle bis Probe-Abstand verringert sich das Sichtfeld und die Auflösung erhöht. Probe-Detektor-Abstand hat den gegenteiligen Effekt. </li></ol> Das ganze Feld in 3D betrachtet werden sollte in denProjektionsbild bei allen Winkeln. Man sollte dies durch Rotation der Probe unter verschiedenen Winkeln und indem man die Probe so nah wie möglich auf die Drehachse zu überprüfen. Dazu sollte man die folgenden Schritte: <ol start="3"><li> Nehmen Sie ein Bild bei 0 Grad, und drehen Sie dann die Probe bei -20 Grad. Wenn die gewünschte Lautstärke seitlich verschoben hat, sollte man seine Position durch Neupositionierung der Rotationsachse zu korrigieren. </li><li> Nach der Korrektur wird die Probe gedreht werden in einem anderen Winkel und die Position korrigiert erneut, bis das Feld von Interesse ist innerhalb des Bildes in allen Winkeln von -90 bis 90 Grad. </li></ol> 5. Hochauflösende Tomogramm <ol><li> Während der Messung wird die Probe gedreht um einen kleinen Winkel zu einer Zeit und an jedem Winkel einen Vorsprung Bild aufgenommen wird. Die Gesamtzahl der Bilder ist immer ein Kompromiss zwischen der gewünschten Auflösung auf der einen Seite und der Zeitpunkt der Messung und die Größe der Datei auf der anderen Seite. Wie in Abb. 2 dargestellt, enthält jede einzelne Projektion alle Scheiben in der Probe überlagert einer über den anderen, und kann daher nicht erkennen die 3D-Struktur der Probe. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Projection Bilder der Lunge von Ratten bei 0 ° (A), 45 ° (B) und 90 ° (C) Drehwinkel. <ol start="2"><li> Nur nach der Einnahme von Projektionsbilder mindestens zwischen -90 und 90 Grad, kann man auf die Rekonstruktion des Probenvolumens gehen. Wiederaufbau dauert zwischen 10 min und 2 Stunden, je nach der verwendeten Software und der Anzahl der Projektionen. Auch hier ist die endgültige Qualität des 3D-Bildes ein Kompromiss zwischen der gewünschten Auflösung und die Zeit will man ausgeben und die Größe der resultierenden Datei. </li></ol> 6. Abbildungsmaßstab Kalibrierung Die Pixel-Ebene (Wert) in einem rekonstruierten Bild ist einzigartig für dieses Bild. Um zwei unterschiedliche Bilder zu vergleichen, hat eine einzigartige Intensität Skala auf jedem Bild verhängt werden. Aus diesem <ol><li> Führen Sie einen Tomographie mit einem Standard-Phantom mit den gleichen experimentellen Bedingungen wie für die Probe </li><li> Kalibrieren Sie den Beispiel-Bild anhand der Werte für das Phantom erhalten. Die häufigsten Skala ist die Hounsfield (oder CT)-Skala. Für 4-fache Vergrößerung Hintergrund Wert von 15.000 (für Wasser oder PBS) wurde mit 0 ersetzt und der maximale Wert von 35.000 für die Knochen wurde mit dem Standard Hounsfield Wert von 3000 ersetzt. Andere Pixelwerte resultierte aus linearen Interpolation oder Extrapolation auf der Grundlage dieser Grenzen. </li></ol> 7. Bildverarbeitung und-analyse Nach Erhalt Bilder mit hoher Auflösung, muss man zu den relevanten Informationen mittels Bildanalyse-Software zu extrahieren. Das Software-Paket verwendet werden muss, um für den Einsatz mit sehr großen Dateien (bis zu 20GB) zu arbeiten. 8. Repräsentative Ergebnisse Eine Darstellung eines Oberschenkelknochens eines C57/BL6 Maus am Embryonaltag 18,5 (E18.5) - Vier Tage nach dem Beginn der Mineralisierung ist in Abb. 3 dargestellt. Die mineralischen Schichten sind deutlich sichtbar (weiß), während Weichteile nicht sichtbar sind in diesem Präparat. Wir Rund 1000 Projektion von Bildern mit einer linearen Vergrößerung von 4x. Die endgültige Auflösung beträgt 8 Mikrometer. Eine sorgfältige Analyse der Volumen-Rendering in Abb.1 dargestellt, zeigt, dass die Knochen Volumenanteil (der Anteil des Knochens Volumen, das von mineralisiertem Gewebe besetzt ist) 0,18 ist, und die Knochendichte ist 723 mg / cm 3. Diese Werte ermöglichen es uns, diese Struktur mit Knochen vergleichen in anderen Stadien der Entwicklung. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Verschiedene Darstellungen eines 3D-Bildes einer Maus Femur Embryo. Die transversale (Querschnitt) (A), sind die sagittale (medio-lateral) Abschnitt (B) und eine Momentaufnahme des Volume-Rendering (C) gezeigt. Abbildung 4 zeigt ein 3D-Bild der Lunge eines weiblichen Aktes Ratte (RNU), 12 Wochen alt, orthotop mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC) NCI-H460 implantiert. 2500 Projektion Bilder wurden mit einer linearen Vergrößerung von 0,5 x genommen, wodurch eine endgültige Auflösung von 16 Mikrometern. Das Bild zeigt die Microfil gefärbten Blutgefäße (bis zu 20 Mikrometer Durchmesser). Das Bild Analyse zeigt, dass 4 Wochen nach der Implantation, multiple Krebsknoten bilden. Sie decken einen erheblichen Teil der Lungenvolumen (17%). Die meisten der pulmonalen Färbung wurde in den Randbereichen der Tumoren gefunden. Deutlich, wie in der Figur 4B gezeigt, sind mehrere Blutgefäße derzeit auch innerhalb der Knötchen, Abdecken, nach vorläufigen Analyse etwa 3% ihres Volumens. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. 3D-Bild von Krebs Knötchen wächst in eine RatteLunge. Eine Momentaufnahme des Volume-Rendering (A) und einen Schnitt durch das Volumen (B) werden gezeigt. Der Krebs Knötchen sind mit Pfeilen markiert. Movie 1. Volume Rendering der Maus Femur in Abbildung 1. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie1.mpg">Klicken Sie hier, um den Film zu sehen.</a> Movie 2. Volume Rendering der Rattenlungen in Abbildung 2. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie2.mpg">Klicken Sie hier, um den Film zu sehen.</a> Movie 3. Serienschnitte durch die Lungen. Die Knoten erscheinen als graue Flächen in den meisten Scheiben schneiden. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie3.mpeg">Klicken Sie hier, um den Film zu sehen.</a>

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C57/BL6 Maus am Embryonaltag 18,5 (E18.5) ist vier Tage nach dem Beginn der Mineralisierung. In diesem Stadium der Entwicklung, ist die Zukunft Knochen aus vielen Schichten der mineralisierten Osteoid gemacht, klar in Abb. 3 zu sehen. An dieser Stelle sollte man betonen, dass mineralisierten Geweben bei geringerer Auflösung visualisiert werden können mit verschiedenen Instrumenten, die weniger Probenhandling erfordern. Das vorliegende Protokoll (und der Mikro-CT Gerät in ihr verwendet) neben der Bereitstellung höherer Auflösung, bietet höchste Flexibilität für den Benutzer zu den besten geometrischen Parameter für die Messung auswählen. Ergebnisse in Abb. 4 zeigen, dass in der orthotopen Lungenkrebs Tiermodellen menschlichen nicht-kleinzelligem Lungenkrebs kann Rekrutierung von Blutgefäßen und Gefäßneubildung zu induzieren. Wir denken, dass das Lungengewebe weder verschoben wurde, noch hat seine Form verändert während der Messung. Der Benutzer sollte besondere Vorsichtsmaßnahmen ergreifen, um solche Veränderungen während einer Tomographie zu vermeiden. Bei einigen Proben, insbesondere für die weichere Gewebe, muss man spezielle Haltevorrichtungen, die perfekt die Probe während der Messung zu immobilisieren zu bauen. Leider ist die Anwesenheit von hohen Leckagen von Kontrastmittel in der Umgebung des Tumors verhindert zuverlässige Quantifizierung der peripheren Blutgefäße. Als Ergebnis werden die Bilder von einigen Färbemittel insbesondere an den Rändern verdorben, was eindeutig in Filmen 2 und 3. Wir konnten dies nicht verhindern verschütten, sondern der nützliche Informationen über die Krebsknoten, einschließlich ihrer Größe, Form und das Vorhandensein von inneren Blutgefäße wurde nicht beeinträchtigt. Wir konnten deutlich feststellen, dass zumindest für die bronchiale Zirkulation, die hier untersucht wurde, periphere Durchblutung in Tumorperfusion beteiligt ist, mit einigen Perfusion präsentieren auch im Inneren des Tumors.

Für Bildaufnahme haben wir ein MICRO XCT-400 microfocussed X-ray tomographischen Systems durch Xradia, Concord, USA, hergestellt werden. Die Bilder wurden bearbeitet und analysiert mit ImageJ (NIH, USA), Avizo (VSG, Frankreich) und MicroView (General Electric, USA) Software-Pakete. Alle verfügbaren Bildanalyse-Software kann ebenfalls verwendet werden,

high resolution 3d imaging of ex-vivo biological samples by micro ct

Zerstörungsfreie Volumen-Visualisierung können nur von tomographischen Techniken, von denen die am effizientesten ist die x-ray micro-Computertomographie (μCT) erreicht werden. Hochauflösende μCT ist ein sehr vielseitiges und doch präzise (1-2 Mikrometer-Auflösung)-Technik für 3D-Untersuchung der ex-vivo biologischen Proben 1, 2. Im Gegensatz zu Elektronen-Tomographie Gegensatz ermöglicht die μCT die Prüfung von bis zu 4 cm dicken Proben. Diese Technik erfordert nur wenige Stunden nach der Messung bis Wochen in der Histologie verglichen. Darüber hinaus bedeutet μCT nicht auf 2D stereologic Modelle verlassen, so kann es zu ergänzen und in manchen Fällen sogar ersetzen histologischen Methoden 3, 4, die sowohl zeitaufwendig als auch destruktiv sind. Probenaufbereitung und die Positionierung in μCT ist unkompliziert und erfordert keine hohen Vakuum oder niedrigen Temperaturen, die sich nachteilig auf die Struktur. Die Probe positioniert ist und um 180 ° oder 360 ° zwischen einem microfocused Röntgenquelle und einem Detektor, der einen Szintillator und eine genaue CCD-Kamera, für jeden Winkel eine 2D-Bild aufgenommen wird einschließt, und dann das gesamte Volumen rekonstruiert wird mit einem der verschiedenen zur Verfügung stehenden Algorithmen 5-7. Die 3D-Auflösung steigt mit der Abnahme der Drehung Schritt. Die vorliegende Video-Protokoll zeigt die wichtigsten Schritte in Vorbereitung, Immobilisierung und Positionierung der Probe durch bildgebende bei hoher Auflösung an.

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High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Zerstörungsfreie Volumen-Visualisierung können nur von tomographischen Techniken, von denen die am effizientesten ist die x-ray micro-Computertomographie (CT) erreicht werden.

Hochauflösende 3D Imaging von Ex-Vivo Biologische Proben von Micro-CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

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High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

Hochauflösende LWL-Mikroendoskopiesysteme für In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Forschung

Biotechnik

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Micro-Particle Image Velocimetry für Velocity Micro Profil Messungen der Blut fließt

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Imaging von biologischem Gewebe durch Desorption Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Herstellung von Mica Unterstützte Lipiddoppelschichten für Hochauflösende Optische Mikroskopie Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Die richtige Positionierung und Zurückhaltung einer Ratte Hind Extremität für fokussierte hochauflösende Bildgebung von Knochen-Mikroarchitektur mit In Vivo Mikro-Computertomographie

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

Hochauflösende 3D Bildgebung des menschlichen Bauchspeicheldrüse Neuro-insularen Netzwerks

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

Hochauflösende Bildgebung von Kerndynamik in Live-Zellen unter Uniaxialer Tensile-Straße

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...