Wir präsentieren Expansionspathologie, kurz ExPath, eine kostengünstige Maßnahme, um Biomoleküle von Interesse in den Standard-Klinikgewebeabschnitten mit nanoskaliger Präzision abzubilden. ExPath umgeht die Beugungsgrenze der konventionellen Lichtmikroskopie, indem es den klinischen Gewebebereich chemisch mit einem wasserschwellbaren Hydrogel einregt und dann die behandelten Proben physikalisch und gleichmäßig um etwa das Hundertfache ausdehnt, so dass zuvor überlappende fluoreszierende Biomoleküle mit einem herkömmlichen optischen Mikroskop getrennt und beobachtet werden können. ExPath ermöglicht es Benutzern, nanoskalige Konfigurationen von krankheitsbedingten Biomolekülen in Gewebeproben zu untersuchen, ohne in neue bildgebende Hardware investieren zu müssen.
So ermöglichen neue Erkenntnisse der Krankheit und fördern neue Diagnosen. Diese Methode kann auf eine breite Palette von Gewebetypen angewendet werden und verwendet werden, um neue Einblicke in die Pathogenese verschiedener komplexer Krankheiten wie Krebs, Gehirnerkrankungen, Autoimmunerkrankungen und andere zu geben. Visuelle Demonstration ist wichtig, um zu veranschaulichen, wie die kritischen Schritte richtig zu tun, wie die Konstruktion der Gelierkammer und die Handhabung der gegelten Probe vor und nach Proteinase K Verdauung.
Beginnen Sie, indem Sie das gewebe von Interesse in ein ExPath-kompatibles Format konvertieren. Wenn Sie mit klinischen FFPE-Proben arbeiten, legen Sie das Dia mit der Probe in eine 50ml konische Röhre und fügen Sie 15ml Zylene hinzu. Kappen Sie das Rohr und legen Sie es drei Minuten lang horizontal auf einen Orbital-Shaker bei ca. 60U/min.
Wiederholen Sie die Wäsche mit weiteren 15 ml Zylene. Dann waschen Sie die Rutsche in einer Reihe von Ethanol Verdünnungen, nach Manuskript Richtungen. Wenn Sie mit gebeizten und montierten permanenten Dias arbeiten, legen Sie jede Rutsche in ein 50ml konisches Rohr, dann bedecken Sie es mit Zylene.
Entfernen Sie den Deckelschlupf vorsichtig mit einer Rasierklinge. Verarbeiten Sie dann den Dia auf die gleiche Weise wie die klinischen FFPE-Proben. Wenn Sie mit unfixierten gefrorenen Gewebedias in OCT-Lösung arbeiten, fixieren Sie das Gewebe in Aceton bei 20 Grad Celsius für zehn Minuten, dann waschen Sie die Proben mit 1X PBS-Lösung dreimal für zehn Minuten pro Wäsche.
Wenn Sie zuvor feste und gefrorene klinische Proben verarbeiten, lassen Sie die Dias für zwei Minuten bei Raumtemperatur, um die OTC-Lösung zu schmelzen, und waschen Sie die Probe dann dreimal mit 1X PBS, für fünf Minuten pro Wäsche. Führen Sie nach der Formatkonvertierung den Antigenabruf für alle Samples durch. 20 Millimolar Citrat-Lösung auf 100 Grad Celsius in einer Mikrowelle erhitzen und die Rutsche in die Lösung legen.
Den Behälter sofort in eine Inkubationskammer geben und bei 60 Grad Celsius für dreißig Minuten bebrüten. Um die Probe zu färben, verwenden Sie einen hydrophoben Stift, um eine Grenze um den Gewebeabschnitt auf der Folie zu ziehen. Legen Sie die Rutsche in eine Petrischale, dann inkubieren Sie das Gewebe mit Sperrpuffer für eine Stunde bei 30 Grad Celsius.
Dann inkubieren Sie das Gewebe mit der primären Antikörperlösung für mindestens drei Stunden bei Raumtemperatur oder 37 Grad Celsius. Waschen Sie das Gewebe nach der Inkubation dreimal mit einem Sperrpuffer und inbrüteten es in sekundärer Antikörperlösung für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur oder 37 Grad Celsius. Wiederholen Sie die Waschungen mit dem Blockierpuffer, und führen Sie dann eine fluoreszierende Bildgebung mit einem herkömmlichen Weitfeldmikroskop oder einem anderen Bildgebungssystem ihrer Wahl durch.
Bereiten Sie die Verankerungslösung gemäß den Manuskriptanweisungen vor. Legen Sie die Dias in eine 100 ml Petrischale, pfeifen Sie die Verankerungslösung über das Gewebe und inkubieren Sie sie mindestens drei Stunden bei Raumtemperatur. Dann bereiten Geling-Lösung nach Manuskript-Anweisungen.
Entfernen Sie überschüssige Verankerungslösung aus dem Gewebeabschnitt und legen Sie die Rutsche wieder in die Petrischale. Fügen Sie der Probe eine frische Kaltgeling-Lösung hinzu und brüten Sie die Mischung dreißig Minuten lang bei vier Grad Celsius an. Um eine Kammer auf der Folie um die Probe zu konstruieren, erstellen Sie Abstandshalter, indem Sie Teile aus Deckglas mit einem Diamantmesser dünn schneiden.
Sichern Sie die Abstandshalter auf beiden Seiten des Gewebes mit Wasser und legen Sie vorsichtig einen Deckel deckel über die Rutsche, um sicherzustellen, dass Luftblasen über dem Gewebe nicht gefangen werden. Dann inkubieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Umgebung für zwei Stunden. Entfernen Sie den Deckel der Gelungskammer, indem Sie eine Rasierklinge vorsichtig unter den Deckelschieben schieben und langsam von der Geloberfläche heben.
Schneiden Sie das leere Gel um das Gewebe, um das Volumen zu minimieren, und stellen Sie sicher, dass das Gel asymmetrisch geschnitten wird, um die Ausrichtung zu verfolgen. Proteinase K ein bis zweihundert im Verdauungspuffer verdünnen, um genügend Lösung vorzubereiten, um das Gel vollständig zu versenken. Dann inkubieren Sie die Probe mit der Lösung in einem geschlossenen Behälter für drei Stunden bei 60 Grad Celsius.
Wenn sich die Probe während der Verdauung nicht löst, verwenden Sie eine Rasierklinge, um sie vorsichtig zu entfernen. Verwenden Sie einen weichen Pinsel, um die Probe in 1X PBS in einem Behälter zu übertragen, der mit dem gewünschten Bildgebungssystem kompatibel ist und groß genug ist, um das vollständig erweiterte Gel aufzunehmen. Waschen Sie die Probe in PBS für zehn Minuten und wenn gewünscht, restain es mit 300 Millimolar DAPI.
Erweitern Sie die Proben, indem Sie die Probe mit einem überschüssigen Volumen von doppelt destilliertem Wasser drei- bis fünfmal für zehn Minuten pro Wäsche waschen. Führen Sie dann fluoreszenzbildgebungsbilden durch. Wenn dieses Protokoll erfolgreich durchgeführt wird, erscheinen Proben nach der mechanischen Homogenisierung als flaches und transparentes Gel und können sich in Wasser um den Faktor 3 bis 4,5 ausdehnen.
Eine fünf Mikrometer dicke FFPE-Nierenprobe wurde 4,5-mal erweitert, was zu einer Auflösung von 63 Nanometern mit einem 0,95 NA-Objektiv führte. Das Gewebe wurde dann in ein Expansionspathologie-kompatibles Format umgewandelt und mit Antikörpern für Alpha Actinin 4 und Vimentin, DAPI zur Visualisierung von Kern-DNA und Weizen-Germa Glutenin zur Kennzeichnung von Kohlenhydraten gefärbt. Die konfokale Mikroskopie der Spinnscheibe wurde dann verwendet, um die Probe abzubilden.
Das Nierengewebe wurde dann vollständig in Wasser erweitert und wieder abgebildet. Risse, Verzerrungen und der Verlust von markierten Zielen können das Ergebnis einer unzureichenden Verankerung oder Homogenisierung sein. Hämatoxylin und Eosin gefärbt normales Brustgewebe wurde als FFPE-Probe behandelt, erweitert, mit DAPI beschriftet und auf einem konokaren Mikroskop der Spinnscheibe abgebildet.
Mit diesem Protokoll wurden auch unfixierte und gefrorene Nierenscheiben verarbeitet. Das Gewebe wurde in kaltem Aceton fixiert und mit Alpha Actinin 4, Vimentin, DAPI und Weizen Germa Glutenin gefärbt. Bei der Durchführung dieser Technik ist es wichtig, sich das Timing des Gelationsschritts zu merken.
Vorzeitige Gelation kann Verzerrungen verursachen, die Ausdehnung begrenzen und zum Verlust von Zielmolekülen führen. Nach diesem Verfahren kann die fluoreszierende Bildgebung nach der Verdauung und Erweiterung der Probe am Mikroskop durchgeführt werden. ExPath kann sowohl in Pathologien als auch darüber hinaus breit angewendet werden.
Da es Forschern ermöglicht, subtile Details in den Gewebeproben von Interesse zu visualisieren. Daher kann es Forschern helfen, neue Erkenntnisse über die Pathogenese von Krankheiten oder Mechanismen biologischer Prozesse zu gewinnen.
