Rezeptor-Clustering ist allgegenwärtig und oft notwendig für die Signalisierung einer Kaskadenaktivierung. Es stehen jedoch nur wenige Methoden zur Verfügung, um den Grad der Clusterbildung zu messen. Wir verwenden die gesamte interne Reflexionsfluoreszenz, die TIRF-Mikroskopie, um die Diffusion von FGFR1-mEGFP-Molekülen in der Plasmamembran lebender Zellen zu verfolgen.
Dann wenden wir die Zahlenhelligkeit, die N&B-Analyse, an, um die Dynamik des stimulierten Rezeptorclusterings zu beschreiben. TIRF ist ideal für die schnelle zeitliche Abbildung molekularer Ereignisse, die in der Nähe der Zelloberfläche auftreten, während N&B den durchschnittlichen oligomeren Zustand von fluoreszierenden Molekülen bestimmt, basierend darauf, wo die Diffusion in und aus dem Beleuchtungsvolumen des Mikroskops erfolgt. Tatsächlich ist dies ein Werkzeug, um die räumliche zeitliche Organisation der Rezeptoren an der Zelloberfläche zu verbinden, wo sie signalisieren.
N&B benötigt nur den Zugang zu einem Mikroskop mit einem schnellen Erfassungsmodul. Sie können große Flächen von lebenden Zellen analysieren, die nur über die Grundlegendenkenntnisse der Fluoreszenzfluktuationsmethoden verfügen. Diese Methode kann auf Proteine angewendet werden, die Dimere oder Cluster bilden und stoichiometrisch mit dem Fluoreszenzfarbstoff gekennzeichnet werden können.
Wenn sich die Proteine in intrazellulären Kompartimenten befinden, werden andere Arten von Mikroskopen zum Erfassen der Bilder verwendet. Es ist wichtig, ein Konstrukt vorzubereiten, das die monomere Form des Fluorophors zum Messen unter experimentellen Bedingungen die reine monomere Helligkeit als Steuerung ausdrückt. Am ersten Tag samen HeLa-Zellen in 1,5 Milliliter n. Medium mit einer Konzentration von 100.000 bis 200.000 Zellen pro Milliliter in Glasbodenschalen.
Samen sechs bis acht replizieren Gerichte, und in einem Brutkasten bei 37 Grad Celsius brüten. Am zweiten oder dritten Tag haben die Zellen die Subkonfluenz erreicht. Fügen Sie der Hälfte der Gerichte ein serumfreies Medium mit Proteinplasmid hinzu und fügen Sie referenziden Plasmide mit dem Monomer und Dimer in die zweite Hälfte der Gerichte ein, um die Zellen zu transfekten.
Überprüfen Sie nach einem Tag, ob die transfizierten Zellen an der Unterseite des Geschirrs haften und die Zellmembran fluoreszierend ist. Entsorgen Sie Gerichte mit überwucherten Zellen oder mit sehr geringer Fluoreszenz. Aktivieren Sie vier Stunden vor dem Experiment den Temperatur-Inkubator des Mikroskops bei 37 Grad Celsius.
Schalten Sie das Mikroskop, Computer und Kameras ein und warten Sie, bis die Kameras die richtige Arbeitstemperatur von minus 75 Grad Celsius erreichen. Legen Sie einen kleinen Tropfen Öl auf die Objektivlinse. Legen Sie eine Probeschale in den Inkubator des Mikroskops, und schließen Sie die Türen des Inkubators, um die Temperatur der Schale für 10 Minuten ausdemieren zu lassen.
Schalten Sie die Epifluoreszenzlampe und den 488-Nanometer-Laser ein. Wählen Sie den Epifluoreszenzkontrastmodus aus, um die Probe zu untersuchen, und suchen Sie eine Zelle, um sie von der Augenlinse aus zu fokussieren. Wählen Sie den richtigen Filter für die Erfassung der grünen Emission durch die Mikroskopkamera mit Bandpass Ex 490/20 500 und Bandpass Em 525/50 oder ähnlich.
Wechseln Sie im Epifluoreszenzmodus vom Okular zum Nockenbericht. Verfeinern Sie den Fokus, und wechseln Sie in den TIRF-Modus. Aktivieren Sie dann die automatische Ausrichtung gemäß den Anweisungen des TIRF-Mikroskops.
Wählen Sie eine geeignete Beleuchtungstiefe und optimieren Sie die Richtung des vereisten Feldes. Wechseln Sie zu einer zweiten Kamera. Definieren Sie einen Interessenbereich von mindestens 256 x 256 Pixeln.
Stellen Sie die Belichtungsposition auf eine Millisekunde und die EM-Verstärkung auf 1.000 ein. Stellen Sie die Laserleistung auf 0,5 Milliwatt ein. Es ist notwendig, einige Informationen über den Diffusionskoeffizienten des Proteins zu haben, da die Expositionszeit kürzer sein muss als die durchschnittliche Zeit, die von den fluoreszierenden Molekülen im luminaten Volumen verbracht wird.
Führen Sie eine erste Testsequenz unter Anfangsbedingungen aus, und schätzen Sie grob den Signal-Rausch-Wert. Die Bedingungen sind bei Signal-Rausch-Wert von zwei bis drei oder höher, gemessen in der ersten Zeitreihe, akzeptabel. Verwenden Sie dann den Schieberegler des Emissionstrennsystems, das die Kamera Nummer zwei mit dem Mikroskop verbindet, um eine Seite des Bildes zu maskieren.
Wählen Sie die Option zum automatischen Speichern der Kameradatei aus. Starten Sie die Erfassung der Bildreihe für mindestens 700 Bilder bei einem minimalen Signal-Rausch-Verhältnis von zwei. Ohne die Schale aus dem Mikroskop zu nehmen, fügen Sie den Liganden hinzu.
Wählen Sie eine Zelle mit einer hellen Fluoreszenzmembran aus, und starten Sie schnell die erste Zeitreihe des kinetischen Laufs. Suchen Sie eine zweite Zelle, und erfassen Sie den zweiten Zeitpunkt der Kinetik. Erfassen Sie eine neue Zelle für jeden Zeitpunkt des kinetischen Laufs.
Wiederholen Sie für jede neue Schale die Ausrichtung der Laserlinie und die Optimierung der TIRF-Beleuchtung. Konvertieren und speichern Sie nun die mit der Kamerasoftware erfassten Bilddateien als tif-Dateien. Importieren Sie tif-Dateien in die Analysesoftwareroutine, indem Sie das grafische N&B-Benutzerinterphase-MATLAB aktivieren.
Discard-Serien, bei denen das durchschnittliche Intensitätsprofil mehr als 10% Photobleaching und Serien zeigt, in denen es während der Erfassung eine offensichtliche Zellmembranverzerrung oder -übersetzung gegeben hat. Zuschneiden von Rahmen, die offensichtlich nicht im Fokus stehen. Halten Sie für die Analyse nur Serie mit mindestens 500 Zeitrahmen.
Bestimmen Sie zunächst die Kameraparameter. Aktivieren Sie die Routine-Kalibrierkamera. Wählen Sie einen Bereich von mindestens 20 x 50 Pixeln im Geräuschbereich des Detektors aus.
Bewegen Sie im Diagramm Protokollfrequenz im Vergleich zum Diagramm der digitalen Ebene den linearen roten Cursor, um den Gaußschen im linearen Teil der Kurve abzugrenzen. Aktivieren Sie die B-Taste. Wenden Sie eine Mindestbinning von 2,2 an, um die Streuung der Daten zu reduzieren und das B-I-Histogramm zu erzeugen.
Verwenden Sie den iterativen quadratischen Cursor, um das B-I-Histogramm zu überprüfen. Wählen Sie einen quadratischen ROI für die Analyse aus, und generieren Sie die B-Karte des ausgewählten ROI. Speichern Sie dann die ASCII-Datei der Der Auswahl zugeordneten B-Werte.
Importieren Sie den ASCII in eine Grafiksoftware, um die Frequenzverteilung der Daten zu berechnen und den durchschnittlichen B-Wert plus oder minus S.E. Zu erhalten. Wenden Sie die Epsilongleichung an, um die durchschnittliche Helligkeit für jede Zelle zu jedem Zeitpunkt des kinetischen Laufs abzuleiten. Normalisieren Sie die Daten gemäß der Normalisierungsgleichung, wobei B't der durchschnittliche B-Wert ist, der zum Zeitpunkt t nach Ligandaddition gemessen wird, und B'0 der durchschnittliche B-Wert ist, der zum Zeitpunkt t gleich Null gemessen wird, was 10 bis 20 Sekunden nach Ligand-Additino entspricht. Zeichnen Sie die normalisierte durchschnittliche Helligkeit im Vergleich zur Erfassungszeit, um den kinetischen Lauf zu erstellen.
In dieser Studie werden hier repräsentative Ergebnisse von zwei HeLa-Zellen in derselben Schale gezeigt, die mEGFP-FGR1 zum Zeitpunkt Null und sieben nach Zugabe von 20 Nanogramm pro Milliliter FGF2 exemittieren. Verglichen mit den Referenzkonstrukten GPI-mEGFP und GPI-mEGFP-mEGFP dimer zeigt die gesamte Analysesequenz die durchschnittliche Intensität der Zeitreihen. Plot aller B-Werte.
B-I Histogramm. B-Karte des gewählten ROI. Und das zugehörige B-Verteilungshistogramm.
Nach der Stimulation mit 20 Nanogramm pro Milliliter FGF2 beschreiben repräsentative kinetische Läufe, die die durchschnittliche Helligkeit zeigen, da die Zeitfunktion den langsamen Prozess der Dimerisierung beschreibt, der mehrere Minuten an der Zelloberfläche anhält. Bei stimulationmitiert mit 50 Mikrogramm pro Milliliter NCAM-Fc zeigt das kinetische Profil schnelle und zyklische Übergänge des Rezeptors in oligomeren Mischungen, die auch Helligkeitswerte über denen des Dimers erreichen. Ein normalisierter Mittelwert von drei wird wiederholt beobachtet.
Es ist wichtig, die zusätzlichen Varianten durch keine molekularen Schwankungen und Bleichen zu minimieren. Und die Zellen müssen gut an der Glasbodenschale haften, nicht überwuchert und nicht aufgetürmt werden. Wenn wir an einem Protein interessiert sind, das schneller in intrazellulären Fächern diffundiert, können wir schneller Null-Zeiten anwenden und das Scannen an Fokal- oder Multiphotonenmikroskopen verwenden, um in der Zelle zu fotografieren.
Mit unserem Ansatz minimieren wir die schädlichen Auswirkungen der Photobleaching, wenn wir die Dynamik von Ereignissen wie Dimerisierung erforschen wollen. Diese Ereignisse steuern eine Vielzahl von zellulären Reaktionen und sind sehr schwierig, in lebenden Zellen mit anderen Techniken zu beweisen.
