Multizelluläre Gewebe komplex, stellt dieses Protokoll zelluläre Verhalten in einer vereinfachten Weise. Eine Sache ist diese Technik, um die direkten Beziehungen zwischen zellulären Leiter protonen und zelluläre Reaktion zu studieren. Dieses Protokoll verwendet chemisch funktionelle Polystyrolperlen, um die Zellleiterprotonen zu rekonstruieren.
Die Perlen können mit allen Protonen von Interesse geschnitten werden, um ihre Auswirkungen auf die zelluläre Reaktion zu testen. Wir haben diese Methode in C-Elegance auf Mausembryonen verwendet. Daher kann dieses Protokoll aufrecht zu den Studien von weit verbreiteten Organismen sein.
Da Embryonen nach einer hohen vollflächigen Chloritbehandlung zerbrechlich sind, ist eine signifikante Praxis erforderlich, bevor man Blastomer erfolgreich isolieren kann. Visuelle Demonstration wird ein besseres Verständnis dafür bieten, wie man Kapillaren während Blastomer-Isolationsmethoden handhaben sollte. Zunächst wiegen Sie 10 Milligramm Carboxylat modifizierte Polystyrolperlen in einem 1,5-Milli-Liter-Mikrozentrifugenrohr.
Fügen Sie einen Milliliter MES-Puffer in das Rohr zum Waschen. Wirbel nisch die Röhre, um die Perlen zu mischen. Drehen Sie das Rohr für 60 Sekunden bei 2000XG über Diebzentrifuge.
Dicard den Überstand durch sorgfältiges Pipettieren des Puffers. Waschen Sie die Perlen erneut mit einem Milliliter MES-Puffer. Nach dem Waschen einen Milliliter MES-Puffer mit 10 Milli-Gramm EDAC in das Rohr geben, um die Oberflächen-Carboxylgruppen zu aktivieren.
Wirbel nisch die Röhre, um die Perlen zu mischen. Drehen und inkubieren Sie das Rohr für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Drehen Sie die Perlen für 60 Sekunden bei 2000XG.
Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie den Puffer vorsichtig ausrohren, und waschen Sie ihn mit einem Milliliter PBS. Wirbeln Sie das Rohr, um die Perlen zu mischen und wiederholen Sie die PBS waschen ein anderes Mal. Bereiten Sie einen Milliliter einer, 10, 100 und tausendfachen Verdünnungsserie von Rhodamine Red-X aus der 0,65-Milli-Liter-Rhodamine Red-X-Lagerlösung vor.
Pippette 20 Mikroliter Perlen in jede serielle Verdünnungsröhre. Drehen und inkubieren Sie die Rohre für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Perlen zweimal mit einem Milli-Liter PBS.
Nach dem Waschen einen Milliliter PBS in die Schläuche geben und bis zu sechs Wochen bei vier Grad Celsius lagern. Überprüfen Sie die Fluoreszenzintensität der Perlen unter einem Mikroskop, das für die Live-Bildgebung verwendet wird. Halten Sie jedes Ende einer Mikrokapillare bei einem Fassungsvermögen von 10 Mikrolitern mit rechter und linker Hand.
Ziehen Sie die Mikrokapillare an beiden Enden, um Spannung aufzutragen, und bringen Sie die Mitte der Kapillare über einen Brenner, um zwei handgezogene Kapillaren herzustellen. Schneiden Sie unter dem Seziermikroskop die Spitzen der handgezogenen Kapillaren mit Zangen. Machen Sie die beiden Spitzenöffnungsgrößen etwa zweimal und ein Mal die kurze Zugangslänge von C-Elegance Embryos für den Embryotransfer bzw. die Eischalenentfernung.
Befestigen Sie die gezogene Kapillare in einem Mund-Pippetting-Gerät. Pippette 45 Mikroliter Eisalzlösung auf einen Brunnen einer mehrwelligen Rutsche. Platz fünf bis zehn Erwachsene C-Elegance auf den Brunnen.
Um frühe C-Elegance-Embryonen zu erhalten, schneiden Erwachsene in Stücke, indem sie zwei Nadeln rechts und links des Körpers von C-Elegance positionieren und die Nadeln aneinander vorbeischieben. Pippette 45 Mikroliter Hypochloritlösung auf einen Brunnen neben der gut haltigen Ei-Salz-Lösung und Pippette 45 Mikroliter von Sheltons Wachstumsmedium auf die folgenden drei Brunnen. Übertragen Sie eine Zellstufe und frühe zwei Zellstadium Embryonen in die Hypochlorit-Lösung durch den Mund Pippette mit der größeren Größe Öffnung und warten Sie für 40 bis 55 Sekunden.
Waschen Sie die Embryonen, indem Sie sie mit Sheltons Wachstumsmedium in die nächsten drei Brunnen übertragen. Mit jeweils ein bis zwei Sekunden in jedem der ersten beiden Brunnen. Mit der handgezeichneten Kapillare mit der kleineren Öffnung sorgfältig wiederholen Rohrleitung den Embryo für die Eischalenentfernung.
Danach pippette kontinuierlich mit der handgezeichneten Kapillare, um die zweizelligen embryonalen Blastomere zu trennen. Nach der Entnahme der Eierschale minimieren Sie die Kraft beim Pippetting der Embryonen nach oben und unten, um ein Platzen zu verhindern. Bereiten Sie eine Bildkammer vor, indem Sie einen Deckelslip auf einen Deckelhalter legen und die Kanten des Abdeckungsslips verkleben, um ihn zu stabalisieren.
Drehen Sie den Deckelhalter, und zeichnen Sie einen Kreis auf dem Coverslip mit einem hydrophoben Stift. Fügen Sie Sheltons Wachstumsmedium innerhalb des vom hydrophoben Marker gezeichneten Kreises hinzu und übertragen Sie das isolierte Blastomere in die Bildkammer innerhalb des Kreises. Geben Sie nun mit der handgezeichneten Kapillare mit der größeren Öffnung ein kleines Volumen der chemisch funktionalisierten Perlen auf den Deckel.
Steuern Sie die Position der Perlen, indem Sie in die handgezeichnete Kapillare blasen, bis sich die Perlen an dem isolierten Blastomer befestigen. Montieren Sie den Deckelschlupf, um die Verdunstung von Medien zu vermeiden, und führen Sie Live-Bildgebung mit einem invertierten Mikroskop durch. In dieser Studie war das fluoreszierende Signal der mit 0,005 Mikrogramm pro Milliliter Rhodamine Red-X Succinimidylester behandelten Perle für den transgenen Stamm, der GFP Miosin-2 und M-Cherihiston exsetiert, zu schwach.
Auf der anderen Seite war das fluoreszierende Signal der perlen, die mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Rhodamine Red-X Succinimidylester behandelt wurden, zu stark. Die Konzentration von Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester bei 0,5 Mikrogramm pro Milliliter war für diesen speziellen transgenen Stamm optimal. Während der Live-Bildgebung wurde eine Ebene identifiziert, wo zwei Zentrosomen vertikal ausgerichtet waren.
Die Ebene mit plus oder minus 90 Grad Winkel dieser Ebene ist Spindelebene. Der Winkel der Spindelausrichtung relativ zur Zell-/Perlenkontaktschnittstelle nach zytokinese zeigt, dass beide Tochterzellen in einer Linie, die beide Kontaktsichten passiert, an der Perle befestigt waren, als Kontaktausrichtung verwendet wurde. Man muss lernen, wie Embryonen und Eierschalen auf bestimmte äußere Kräfte reagieren, die von der Mundpippette angewendet werden.
Theoretisch kann jede zelluläre Reaktion untersucht werden, zum Beispiel kann die Sulfatspezifikation durch Kultivieren von Zellen und Kontakt mit Klebeperlen über längere Laufzeiten untersucht werden. Diese Technik wurde verwendet, um den kontaktabhängigen Ausrichtungsmechanismus für die Zellteilung zu verstehen. PTF-Filter wurde verwendet, um das Einatmen von Dämpfen der Hypochloritlösung über Mundpippette zu verhindern.
