Sternchen (*) zeigen an neuen oder modifizierten Schritten im Vergleich zu Christensen et al. 1 1. Material Einstellungs <ol><li> Das Zellkulturverfahren erfordert große Mengen an Eiern von schwangeren Erwachsenen isoliert. Wachsen C. elegans auf Agar-Platten ausgesät 8P mit NA22 (durch C. elegans Genetic Consortium - CGC) Bakterien, um große Mengen von Eiern zu isolieren. In diesen Platten die Menge Pepton verwendet wird, ist 8-mal der Betrag, der normalerweise für die NGM-Platten verwendet. Je höher Peptonkonzentration trägt das Wachstum von Bakterien NA22 effizienter, was gegen OP50-, wachsen in dicken Schichten. </li></ol> 8P Platten Rezept: Man löst 3 g NaCl, 20 g Bacto-Pepton, 25 g Agar in 1 l sterilem destilliertem Wasser und Autoklaven für 30 min. Lassen Sie das Medium kühl bei 55 ° C und fügen Sie dann steril filtriert 1 ml Cholesterin (5 mg / ml in EtOH), 1 ml 1 MgCl 21 ml MgSO 4 und 25 ml KP-Puffer (Lager von 500 ml: 5 g K 2 HPO 4, 30 g KH 2 PO 4, pH-Wert 6,00). Gießen flüssigen Agar-Medium in 10 cm Petrischalen (25 ml / Platte). <ol start="2"><li> Der nächste Tag verteilt die ganze Oberfläche jeder bereichert Pepton-Agar-Platte mit 1 ml NA22 E. coli über Nacht in 2XYT-Medien (16 g Trypton, 10 g Hefeextrakt, 5 g NaCl in 1 l sterilem Wasser, pH 7,0) bei 37 ° C. Diese Bakterien bilden eine reiche Nahrungsquelle, die eine dicke Schicht, die das Wachstum von großen Mengen von schwangeren Erwachsenen bilden. Lassen beimpften Platten über Nacht bei Raumtemperatur, um das Wachstum der Bakterien zu ermöglichen. Das Verfahren kann durch Inkubation bei 37 ° C für 4-5 h beschleunigt werden. </li><li> Übertragen Sie verhungerten Tiere geimpft 8P Platten. Waschen Sie weg von einer ausgehungerten Tiere NGM Platte mit 5-6 ml M9-Puffer oder Wasser und fügen Sie 1-2 ml dieser Suspension auf jeden 8P Platte. </li><li> Ermöglichen Wachstum und die Vermehrung der Tiere until die Platten bei Zusammenfluss von schwangeren Erwachsenen bevölkert. </li><li> Isolierung der für die Herstellung von C benötigt Eier elegans embryonalen Zellen, von der schwangeren Erwachsenen mit 5-6 ml Lyse-Lösung. </li></ol> Die Lyse-Lösung Rezept 5 ml frischem Bleichmittel, 1,25 ml 10 N NaOH und 18,5 ml sterilem H 2 O. Diese Mischung muss frisch zubereitet vor jedem Einsatz werden. <ol start="6"><li> Waschen Sie die Eier von schwangeren Erwachsenen mit Ei Puffer isoliert: </li></ol> Egg Puffer Rezept 118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 25 mM Hepes, pH 7,3 Osmolarität 340 mOsm. <ol start="7"><li> Entfernen Sie die Eierschale, die die Eier umgibt, durch Behandlung mit Chitinase. Chitinase ist ein Enzym mit der höchsten Aktivität bei sauren pH-25. Auflösen Chitinase (Sigma, Katalog-Nr. C6137) in Ei-Puffer pH 6,5 auf eine Endkonzentration von 2 mg / ml. Bewahren Sie die Chitinase LagerLösung bei -20 ° C in 1 ml Aliquots in sterilen 15 ml konischen Röhrchen. Aliquots bei -20 ° C bis zu einigen Monaten gelagert werden. </li><li> Wachsen C. elegans kultivierten Zellen auf Deckgläser autoklaviert (12 mm Durchmesser) mit Erdnuss-Lektin bedeckt. Auflösen Erdnuß-Lectin in sterilem Wasser (0,5 mg / ml). Peanut Lektin-Lösung sollte nicht gefiltert oder autoklaviert werden. Es ist auch nicht brauchen, um mit UV-Licht behandelt werden. Speicher 2 ml Aliquots bei -20 ° C für bis zu 6 Monate. </li><li> Kompletten Zellkulturmedium (500 ml) enthält 500 ml L-15-Kulturmediums von Gibco, 50 ml fötales Rinderserum (hitzeinaktiviert), 7,7 g Saccharose (45 mOsm), 5 ml 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin (2%). Das komplette Medium wird dann unter Verwendung eines 0,20 &amp;mgr; m Porenfilter filtriert. </li></ol> Beachten Sie, dass das Ei-Puffer und das Kulturmedium haben Osmolarität von 340 bis 345 mOsm auf. Denn im Gegensatz zu Säugerzellen, C. elegans-Zellen weisen eine relativ hohe Osmolaritätdass muss in Zahl bei der Herstellung von Lösungen, die in direktem Kontakt mit der Plasmamembran der Zellen kommen genommen wird. Die Rezepte dieser Reagenzien wurden angepasst, um die gewünschte Osmolarität, die mit einem Osmometer 1 gemessen wurde, zu erreichen. Es ist nicht notwendig, einen Osmometer verwenden, wenn diese Rezepte genau befolgt und Sorgfalt bei der Herstellung dieser Reagenzien verwendet. Allerdings sollte man eine Osmoter verwenden, wenn andere Lösungen müssen darauf vorbereitet sein, deren Rezepte werden hier nicht gemeldet oder in einer der Publikationen, die C verwenden elegans kultivierten Zellen. 2. Egg Isolation <ol><li> Es wird empfohlen, mit mindestens vier 8P Platten beginnen, um genug Eier für 12 Vertiefungen von kultivierten Zellen zu sammeln (in 24-Well-Platten). </li><li> Bevor Sie mit dem Verfahren aufzutauen eine Tube Lektin Erdnuss-Stammlösung. Platzieren autoklaviert Deck am Boden der Vertiefungen in einer Platte mit 24 Vertiefungen und mit 200 ul Erdnuß-Lectin auf die Deckgläser. Inkubation für 1 h oder until die Zellen bereit sind, beschichtet werden. Komplett entfernen die Erdnuss Lektin und waschen Sie die Vertiefungen einmal mit 1 ml sterilem Wasser autoklaviert. Vollständige Entfernung des Erdnuß-Lectin aus den Deck ist wichtig zur Vermeidung Zellverklumpung. </li><li> Von den Agar-Platten mit sterilen autoklaviertem Wasser waschen schwangeren Erwachsenen. Sammeln Sie die Suspension in zwei sterile 50 ml konischen Röhrchen. Lassen Sie die Röhrchen auf Eis für 5 min zur Ausfällung der Schnecken am Boden der Rohre (*) zu ermöglichen. Entfernen Sie das Wasser mit einem Transfer Plastikpipette und ersetzen Sie es mit frischen steril autoklaviert Wasser. Pellet Würmer durch Tisch-Zentrifugation bei 200 xg (~ 1.200 rpm) für 10 min (*). Wiederholen letzten Schritt mindestens 3 ist. </li><li> Übertragen Würmer in einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen und pelle sie bei 200 × g (~ 1200 rpm) für 10 min (*). Höhere Zentrifugationsgeschwindigkeit nicht verwenden, um zu vermeiden das Sammeln der Bakterien an der Unterseite des Rohres als auch. Manchmal nach Zentrifugierungen die Würmer nicht vollständig pelletiert. After jeweils waschen und vor dem Entfernen der Überstand, legen Sie die Röhrchen für 5 min auf Eis. In gekühltem Wasser Würmer auszufällen zum Boden des Röhrchens. </li><li> Entfernen Sie das Wasser und geben Sie 5-6 ml Lyse-Lösung (siehe Material einrichten). Rock the Federung sanft für 5-10 min und dann beginnen die Überwachung Wurm Lyse unter dem Stereomikroskop alle 2-3 min. Ein Tropfen der Suspension kann auch auf ein Deckglas für eine einfachere Überprüfung platziert werden. Die Inkubationszeit variiert abhängig von der Frische der Bleichmittel, kaufen kleine Flaschen Bleichmittel, und öffnen Sie eine neue Flasche jeden Monat. </li><li> Wenn ~ 70-80% der Würmer werden lysiert (10 min von Beginn der Inkubation), stoppen Sie die Lyse-Reaktion durch Zugabe von 9 ml Ei-Puffer pH 7.3 (siehe Material einrichten). Zentrifugieren Sie die Suspension bei 200 xg (~ 1.200 rpm) für 10 min. Von diesem Punkt an eine Bunsenbrenner auf, die auf der Bank, um eine erneute Verunreinigung der Eier (*) zu verhindern. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer sterilen Plastiktransferpipette und waschen das Pellet 3-4x mit Ei Puffer, bis die Lösung klar ist. Stellen Sie sicher, um das Pellet auch in der Eierpuffer während jeder Wäsche mischen. </li><li> Die Eier werden von den Tierkörpern unter Verwendung von 30% Saccharose-Lösung getrennt. Das Pellet in 2 ml steriler Ei-Puffer und 2 ml 60% Saccharose-Lösung (Lager in sterile Ei-Puffer). Gut mischen und zentrifugieren für 20 min bei 200 xg (~ 1.200 rpm) (*). </li><li> Die Röhren vorsichtig aus der Zentrifuge zu entfernen. Die Eier sind an der Oberseite der Lösung schweben. Mit einer Pipette und P1000 sterile Spitzen, übertragen alle Eier in ein frisches steriles 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> 10 ml sterile Puffer Ei mit dem Rohr und Zentrifuge bei 200 × g (~ 1200 rpm) für 10 min. Wiederholen Sie den Wasch 3 x. Sicherzustellen, dass die Eier vollständig in das Ei während jedes Waschpuffer resuspendiert. </li></ol> 3. Embryonic Cells Dissoziation Führen Sie die nächsten Schritte des Verfahrens unter sterilen Bedingungen mit einem Steril. Während Tiere sindKleid auf Bakterienplatten, der Waschungen und der Behandlung mit der Lyse-Lösung mit Bleichmittel sollten die meisten, wenn nicht zu eliminieren alle Bakterien. Somit eine Laminar-Abzugshaube an diesem Punkt des Verfahrens verhindert, dass neue Verunreinigung der Eiersuspension. <ol><li> Resuspendieren pelletiert Eier in 1 ml 2 mg / ml Chitinase (Lager in Ei-Puffer pH 6.5 (*)) und übertragen sie auf eine neue sterile 15 ml konischen Röhrchen. Rock das Rohr für 10-30 min bei Raumtemperatur. Die genaue Inkubationszeit ändert sich entsprechend der Frische des Enzyms und der Temperatur des Raums und ist daher für jede Präparation bestimmt werden. Es wird empfohlen, die Überwachung der Eier unter einem Umkehrmikroskop die Zellkultur nach 10 min Inkubation zu starten. Hinweis: in unserer Erfahrung, erhöht niedrigen pH-Wert die Chitinase enzymatische Aktivität. Aus diesem Grund verwenden wir Ei-Puffer bei pH 6,5 bis Chitinase (Rezept oben berichtet, in der pH-Wert auf 6,5 mit NaOH) aufzulösen. </li><li> Bei ~ 80% der Eierschalen durch die verdauteChitinase-Behandlung (Fig. 1 AB), pelletieren Sie die Eier durch Zentrifugation bei 900 × g (~ 2500 rpm) für 3 min (*). Mit einer Pipette und P1000 sterile Spitzen, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und 3 ml L-15-Medium (*). </li><li> Übertragen Sie die Eier in eine Platte Durchmesser 6 cm und sanft distanzieren die Zellen mit einem 10 ml sterile Spritze mit einer 18 G-Nadel ausgestattet. Überwachen Sie den Grad der Dissoziation, indem ein Tropfen der Suspension in eine frische Petrischale aus Kunststoff und durch Betrachtung unter dem Mikroskop. Während dieses Vorgangs Luft in die Spritze anzusaugen nicht zu schädlichen Zellen zu vermeiden. Weiterhin die Dissoziation bis ~ 80% der Zellen dissoziiert. </li><li> Filtern Sie die Suspension mit einer sterilen 5 um Millipore-Filter. Zellsuspensionen werden müssen, um Zellklumpen, unverdaute Eier und geschlüpften Larven entfernen gefiltert werden. Filter zusätzliche 4-5 ml frischem L-15-Medien durch den Filter, um alle Zellen zu erholen. Während des Filtrationsschritt Verwenden Sie nicht zu viel Kraft zu vermeiden, daMaging den Filter und / oder die Zellen. </li></ol> 4. Kultivieren von Zellen <ol><li> Pellet die dissoziierten Zellen durch Zentrifugation bei 900 × g (~ 2500 rpm) für 3 min (*). Mit einem P1000 Pipette und sterilen Spitzen sorgfältig entfernen Sie alle den Überstand. Resuspendieren der pelletierten Zellen in komplette L-15-Medium und der Platte 1 ml / well. Die Menge des dem Medium zugesetzt wird, hängt von der Anzahl der 8P-Platten verwendet, die Mündung der Würmer auf den Platten, und die Art von Experimenten, die von den Zellen durchgeführt wird. Die Zelldichte kann unter Verwendung einer Zählkammer bestimmt. Für Patch-Clamp-Aufnahmen Beschichtungs-Dichte von ~ 230.000 Zellen / cm 2 ist optimal. </li><li> Halten Sie die 24 Vertiefungen in einer Kunststoffplatte Tupperware-Behälter, nasse Handtücher um die Verdampfung des Kulturmediums zu vermeiden. Speicherung der Behälter in einem befeuchteten Inkubator bei 20 ° C und der Umgebungsluft. </li><li> Die Zellen sind in der Regel bereit, für die Experimente innerhalb von 24 Stunden, wenn die morphologische Differenzierung und ExpressIon der GFP-Marker sind abgeschlossen. Zellen in Kultur für bis zu 2 Wochen aufbewahrt werden, aber sie sind in der Regel die meisten gesunden bis zu 7-9 Tage nach der Plattierung. Das Medium muss einmal täglich an gesunden Zellen aufrechtzuerhalten ersetzt werden. </li></ol>

C. elegans ist ein leistungsfähiges Modellorganismus für die Entschlüsselung der genetischen Pfade in der Entwicklung, Verhalten und Alterung beteiligt. Seine Bequemlichkeit liegt vor allem in der Leichtigkeit, mit der sie genetisch manipuliert werden können und von seiner kurzen Lebenszyklus. Trotz seiner Bequemlichkeit, C. elegans hat seine Grenzen. C elegans-Zellen sind klein und in einem unter Druck Cuticula, die die Anwendung von Verfahren, die direkten Zugriff auf die Zellen, wie ele...

Caenorhabditis elegans (C. elegans) ist ein leistungsfähiges Modellorganismus für die Untersuchung der molekularen Grundlagen der zellulären Funktion, Differenzierung und Verhalten. Während sein Genom, Stoffwechsel-und Biosynthesewege ähnlich Wirbeltiere &quot;sind, sind die genetischen und molekularen Lenkbarkeit weit größer 2. Einer der Vorteile sind seine Größe und einfache Anatomie, seiner schnellen Lebenszyklus (3 Tage bei 25 ° C), kurze Lebensdauer (2 Wochen) und große Anzahl von Nachkommen (&gt; 200). Aufgrund seiner Zwitter Natur und kurzen Lebenszyklus, sind molekulare und genetische Manipulationen einfach in C. elegans, einschließlich der Erzeugung von transgenen Tieren 3,4 und die Anwendung der Gen-Knock-down-Verfahren, wie RNA-Interferenz-5. C elegans Körper und Eierschale sind transparent. Daher Zellen leicht sowohl in der Erwachsenen-und der Embryo mit Standard-Mikroskopie sichtbar gemacht werden. In den letzten 40 Jahren hat sich die C. elegans </em&gt; Gemeinde hat wertvolle Ressourcen für C erstellt elegans Forschung, darunter eine große Sammlung von Mutanten, Knockouts und Transgenen, eine detaillierte Beschreibung der Anatomie und Entwicklung 6,7, einschließlich der vollständigen Rekonstruktion des Nervensystems 8, und ein Genom vollständig sequenziert, die gut kommentierten und verfügbar für die ganze Gemeinde ( <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a> ). Trotz der zahlreichen Vorteile, haben einige experimentelle Ansätze in C. Herausforderung worden elegans. Dazu gehören diejenigen, die Zugang zu der Plasmamembran der Zellen und Isolierung von Geweben oder Zelltypen erforderlich. Tatsächlich C. elegans Gewebe in seinem hydrostatischen Druck Skelett, das nicht leicht durch enzymatische Behandlung oder Detergenzien aufgeschlossen wird beschränkt. Am Ende der 1990er Jahre Miriam Goodman und Janet Richmond Pionier Methoden zur elektrophysiologischen Ableitungen von C. elegansNeuronen und Muskelzellen in situ 9,10. Während diese Verfahren gab uns wichtige Einblicke in die neuronalen und Muskelfunktion in vivo, sie sind anspruchsvoll und geringem Durchsatz. Alternative Methoden, um die Zellfunktion in vivo zu untersuchen entwickelt worden, meist vor allem in vivo Calcium Imaging mit genetisch kodierte Kalzium-Sensoren wie GCamP und came 11-13. Diese Methoden aber nicht die Verwendung von pharmakologischen Tools ermöglichen, weil sie auf intakten lebenden Tieren angewendet. Der erste Versuch Kultivierung C. elegans-Zellen in vitro in großem Maßstab wurde von Laird Bloom während der Vorbereitung seiner Doktorarbeit 14 gemacht. Leider mit schlechter Adhäsion der Zellen an das Substrat auf Schwierigkeiten gestoßen, schlechte Zelldifferenzierung und das Überleben verhindert die Einrichtung dieser frühen Protokoll als robuste Zellkulturverfahren. Im Jahr 1995 Edgar und Kollegen veröffentlichten eine ProzedurZellteilung und Morphogenese durch Isolierung und Kultur von einer einzigen C zu untersuchen. elegans Embryonen 15. Embryonale Zellen durch Verdau der Eierschalen mit einer Kombination aus enzymatischer Behandlung und manuelle Dissoziation erhalten, weiter zu vermehren, produzieren bis zu ~ 500 Zellen 15. Anschließend Leung und Mitarbeiter kultiviert eine kleine Anzahl von Blastomeren Darm Morphogenese studieren. Sie zeigten, dass eine in vitro isolierten E Blastomere hergestellt polarisierten Darmzellen, die eine analoge Struktur des Darmlumens durch Wechselwirkung miteinander durch apikalen Adhärenzverbindungen 16 angelegt. Büchner und Kollegen auch ein ähnliches Verfahren für die Kultivierung C. elegans embryonalen Zellen in vitro 17. Basierend auf dieser frühen Arbeit Tensen und Kollegen entwickelt einen robusten Protokoll zur Kultivierung von embryonalen C. elegans-Zellen in vitro 1. Siezeigten, dass isolierte C. elegans-Zellen können in verschiedene Zelltypen zu differenzieren und Aufrechterhaltung der Funktionen, die sie in vivo besitzen, einschließlich der Expression von zellspezifische Marker. Verschiedene Techniken, die in vivo eine Herausforderung sind, können auf isolierte C angewendet werden elegans embryonalen Zellen. Diese umfassen elektro 1,18 19, Bildgebung und immunchemische Techniken 20,21, sowie die Isolierung von spezifischen Zelltypen durch Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) für den Aufbau von Zell-spezifische cDNA-Bibliotheken 22,23. Gen-Knockdown-Techniken wie RNA-Interferenz (RNAi) auf kultivierte C angewendet werden elegans-Zellen 1 und ein neuartiges Verfahren unter Verwendung von metabolischer Markierung Azido-Zucker als Werkzeug für Glykoprotein Entdeckung wurde kürzlich für die in vitro kultiviert C entwickelt elegans Zellen 24. Im Ergebnis dehnt sich das Zellkulturverfahren der Anordnung of Techniken, die dem C angewendet werden können elegans-Modell in dem Bemühen, Gen-Funktion in Zusammenhang mit einem lebenden Organismus zu entschlüsseln. Wir beschreiben hier das Protokoll für die Kultivierung von C. elegans embryonalen Zellen in vitro, die weitgehend auf dem Protokoll zuerst von Christiansen und Kollegen 1 beschrieben basiert.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar Granulated</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-784</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase from Streptomyces Griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6137-25UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA22 Escherichia coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peanut Lectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57903-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67528-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0396-25G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57653-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500 g</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved distilled H2O</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-1000 &mu;l Blue Graduated Pipet Tips</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &mu;l) Pipettor with tip ejector</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>89079-974</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet Aid, Drummond</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Plastic Pipet Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>14670-114</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1475-1611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 18 gauge Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305482</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &mu;m pore size</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431224</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &mu;m versapor Membrane</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>28144-095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-548</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-912</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm Diameter Glass Coverslips</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>48300-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>6902A09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5- Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022629883</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope with x10 objective</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambient air humidified Incubator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for culturing embryonic c. elegans cells

C. elegans ist ein leistungsfähiges Modellsystem, in der genetischen und molekularen Techniken sind leicht anwendbar. Bis vor kurzem aber Techniken, die direkten Zugang zu den Zellen und Isolierung von spezifischen Zelltypen benötigen, konnten nicht in C angewendet werden elegans. Diese Beschränkung resultiert aus der Tatsache, dass Gewebe in einem unter Druck Kutikula, die nicht leicht durch die Behandlung mit Enzymen und / oder Detergenzien aufgeschlossen wird beschränkt. Basierend auf frühen Pionierarbeit von Laird Bloom, Christensen und Kollegen entwickelten ein ein robustes Verfahren für die Kultivierung von C. elegans embryonalen Zellen in großem Maßstab. Die Eier werden von schwangeren Erwachsenen durch Behandlung mit Bleichmittel / NaOH isoliert und anschließend mit Chitinase behandelt, um die Eierschalen zu entfernen. Embryonale Zellen werden dann durch manuelles Pipettieren dissoziiert und auf das Substrat beschichtete Glas im Serum angereicherten Medien ausplattiert. Innerhalb von 24 Stunden von Isolationszellen beginnen, indem Morphologie und durch zellspezifische marke ausdrücken unterscheidenrs. C elegans Zellen mit dieser Methode kultiviert überleben bis 2 Wochen in vitro und haben für elektrophysiologische, immun verwendet, und Bildanalysen sowie wurden sie sortiert und für die Microarray-Profiling eingesetzt.

C. elegans kultivierten Zellen zu differenzieren und Express-Zell-spezifische Marker Christensen und Kollegen mit Trypanblaufärbung gezeigt, dass&gt; 99% der embryonalen C. elegans Zellen überleben die Isolierungsverfahren. Am Tag 9 und 22 nach dem Plattieren, 85% und 65%, bzw. 1 sind noch am Leben. Isoliert embryonalen C. elegans-Zellen müssen auf ein Substrat, um zu unterscheiden haften. Zellen, die Klumpen bilden nicht einhalten und es ist nicht klar,...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells at JoVE.com

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

Wir beschreiben hier eine überarbeitete Protokoll für die groß angelegte Kultur von embryonalen C. elegans-Zellen. Embryonale C. elegans in vitro kultivierte Zellen unter Verwendung dieses Verfahrens scheinen in einer zellspezifischen Weise zu differenzieren und zu rekapitulieren, die Expression von Genen. Techniken, die direkten Zugriff auf die Zellen oder Isolierung von spezifischen Zelltypen aus den anderen Geweben erfordern kann auf C angewendet werden elegans kultivierten Zellen.

Ein Verfahren zur Kultivierung von embryonalen<em&gt; C. elegans</em&gt; Zellen

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

a-method-for-culturing-embryonic-c-elegans-cells

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

15.4K Aufrufe.  University of Miami.  Wir beschreiben hier eine überarbeitete Protokoll für die groß angelegte Kultur von embryonalen C. elegans-Zellen. Embryonale C. elegans in vitro kultivierte Zellen unter Verwendung dieses Verfahrens scheinen in einer zellspezifischen Weise zu differenzieren und zu rekapitulieren, die Expression von Genen. Techniken, die direkten Zugriff auf die Zellen oder Isolierung von spezifischen Zelltypen aus den anderen Geweben erfordern kann auf C an...

Serie: A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Forschung

Biologie

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

Die Anwendung eines C. elegans Dopamin Neuron Degeneration Assay für die Validierung von potenziellen Parkinson Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Erzeugung von transgenen C. elegans Nach Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

Die Produktion von C. elegans Transgene via Recombineering mit dem GalK Selektionsmarker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

Robuste Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Ein System für<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultivierung von embryonalen Pankreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemotaxis-Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...