Was wir hier präsentieren, ist eine robuste und einfache Methode zur Analyse der Mikrotubuli-Dynamik mit Live-Zell-Spinnscheibe konfokale Bildgebung in Zellen, die in Prometaphase synchronisiert sind, und Bilder werden anschließend auf einer MATLAB-basierten Plattform analysiert. Die Verwendung von rot verschiebbarem fluoreszierendem Protein in Kombination mit der Spinnscheibenmikroskopie reduziert die Phototoxizität. Daher kann eine größere Anzahl von Zellen innerhalb derselben Zubereitung abgebildet werden.
Die Mikrotubuli-Dynamik wird in einer Vielzahl pathologischer Bedingungen verändert. Daher kann das Verständnis der Regulierung und des Verhaltens der Mikrotubuli-Dynamik in diesen Prozessen uns helfen, den Mechanismus der Krankheit zu verstehen und schließlich Therapien zu entwickeln, um sie zu kompensieren. Und die Methode ist auch hochskalierbar, so dass es möglicherweise in einer Drogenentdeckung Bemühungen angewendet werden könnte.
Die Methode kann geändert werden, indem das Fluoreszenzdesynchronisationsprotokoll geändert und Zellen aus verschiedenen Phasen des Zellzyklus erhalten werden. Dies kann nützlich sein, wenn Medikamente gegen Mikrotubuli screening und Fehler bei teilenden und nicht teilenden Zellen identifiziert werden. Es ist notwendig, das Transfektionsprotokoll und die Saatdichte für jeden Zelltyp zu optimieren.
Der Expressionspegel von EB3 sollte niedrig sein, um einzelne wachsende Mikrotubuli zu erkennen. Beginnen Sie mit dem asynchron wachsenden HeLa-Zellen in DPBS, dann inkubieren Sie sie mit Trypsin-EDTA für fünf Minuten, bei 37 Grad Celsius. Stoppen Sie die Trypsinisierung durch Hinzufügen von RPMI-1640 Medium ergänzt mit 10%Wärme inaktivierten FCS in einem Verhältnis von drei zu eins, die hinzugefügttrypsin-EDTA.
Berechnen Sie die Konzentration der Zellen nach Manuskriptrichtungen und säen Sie 50.000 Zellen in jeden Brunnen eines vorbereiteten, kammerigen Deckels. Bringen Sie den Deckelrutsch in den Inkubator zurück und wachsen Sie Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Am nächsten Tag entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator, und tropfenweise fügen Sie 100 Mikroliter Transfektionsmischung in jedem Brunnen.
Geben Sie die Zellen in den Inkubator zurück und ergänzen Sie die Zellen nach vier Stunden Inkubation mit frischem Medium und brüten sie zusätzlich für 20 Stunden. Bereiten Sie eine 2,5 Mikromolar-Lösung von Dimethylenastron, oder DME, in phenolrot freiem DMEM, ergänzt mit 10%FCS und zwei Millimolar L-Glutamin. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium im kammerierten Coverslip durch das DME-Wachstumsmedium, und geben Sie die Zellen an den Inkubator zurück.
Nach 3,5 Stunden Inkubation, übertragen Sie die Zellen auf das Mikroskop durch Montage der kammerierten Abdeckungslip in eine Umweltkammer auf 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid eingestellt, mit dunklen Platten für die Bildgebung. Dann setzen Sie die Inkubation für insgesamt vier Stunden fort. Führen Sie die Zeitraffer-Bildgebung auf einem invertierten Mikroskop mit einer 100X, 1,49 numerischen Blende, Öl-Immersion-Objektiv, einem Dual-Disk-Konfokalsystem und einem zuverlässigen Autofokus-System durch.
Definieren Sie die Bildparameter, wie im Textmanuskript beschrieben. Finden Sie eine Zelle in prophase, und fokussieren Sie sich in der Z-Ebene, die dem Zentrum der monopolaren mitotischen Spindel entspricht. Dann erfassen Sie Bilder alle 5 Sekunden, über insgesamt eine Minute, ohne Binning und ohne Beleuchtung zwischen belichtungen.
Laden Sie zunächst die numerische Analysesoftware und fügen Sie den Ordner u-track V2.2.0 aus dem Befehlsfenster in den Softwaresuchpfad, die so genannte Filmauswahl-GUI, ein. Importieren Sie dann die von der Bildaufnahmesoftware generierten Rohdateien. Geben Sie manuell die numerische Blende des Objektivs und das Zeitintervall ein, das für die Bildgebung verwendet wird.
Sobald alle Bilder geladen sind, speichern Sie die eingegebene Zeitrafferserie als Film, indem Sie speichern als Filmliste und die U-Spur-Option auf der rechten Seite des Dialogfensters auswählen. Wählen Sie microtubule plus-ends aus dem Popup-Menü aus, und klicken Sie auf OKAY, das ein neues Dialogfenster öffnet, um die Parameter der drei Schritte der Analyse zu bestimmen. Klicken Sie für Schritt 1 auf Einstellungen, und wählen Sie die Kometenerkennung aus dem Dropdown-Menü aus.
Definieren Sie die Parameter für die Differenz des Gaußschen Filters und die Einzugsgebietssegmentierung, wie im Manuskript beschrieben. Wählen Sie dann Einstellungen auf alle Filme anwenden aus, und klicken Sie auf Anwenden. Wählen Sie für Schritt 2 die Microtubule-Plus-End-Dynamik aus, und verwenden Sie die Einstellungsoptionen, um die Werte für Verknüpfung, Lückenschließen, Zusammenführen und Aufteilen sowie Kalman-Filterfunktionen entsprechend dem Textmanuskript zu definieren.
Bei Problemen mit der Dimensionalität wählen Sie zwei aus dem Dropdown-Menü aus, und verwenden Sie fünf Frames für den maximalen Abstand zum Schließen und drei Frames für die minimale Länge der Spursegmente vom ersten Schritt an. Wählen Sie wie bisher Einstellungen auf alle Filme anwenden aus, und klicken Sie auf Anwenden. Wählen Sie für Schritt 3 die Klassifizierung der Mikrotubuli-Dynamik als Trackanalysemethode aus, und definieren Sie die Parameter über die Einstellungsschaltfläche.
Wählen Sie die Felder zum Entfernen von Spuren am Anfang und Am ende des Films aus, und erstellen Sie Statistik-Histogramme. Wählen Sie in der Dropdown-Liste zwei bis drei Frames vor der Vorwärtsspalt- und 95. Perzentil der Vorwärtsspalt-Geschwindigkeitsverteilung für die Vorwärts- bzw. Rückwärts-Reklassifizierung aus. Sobald alle Parameter definiert sind, wählen Sie Check/Uncheck auf alle Filme anwenden aus, und führen Sie alle Filmfelder aus dem U-Track-Fenster der Steuerbereiche aus, und drücken Sie dann die Ausführungtaste.
Eine Meldung wird angezeigt, sobald die Filmverarbeitung abgeschlossen ist. Das pEB3-tdTomato Plasmid wurde vorübergehend in HeLa-Zellen exprimiert. Die Zellen wurden mit der DME-Behandlung synchronisiert.
Zeitrafferfilme des Mikrotubuli-Wachstums wurden analysiert und die daraus resultierende Wachstumsgeschwindigkeit und Dynamik gezeichnet. Die beschriebenen Parameter, die sich auf die Analyse auswirken, z. B. maximale Spaltlänge und maximaler Schrumpfungsfaktor, wurden für denselben Satz von Zeitrafferfilmen geändert. Die entsprechenden Werte für Wachstumsgeschwindigkeit und Dynamik wurden berechnet.
Während die resultierende Wachstumsgeschwindigkeit nicht signifikant beeinflusst wurde, war die Dynamik anders, als die maximale Spaltlänge geändert wurde. In allen drei Fällen war der Nachweis von Mikrotubuli-Subtracks ähnlich, aber die Rekonstruktion der gesamten MT-Trajektorien wurde hauptsächlich beeinflusst, als die maximale Spaltlänge auf 15 festgelegt wurde. Um zu beurteilen, ob bildgebende Bedingungen das Mikrotubuli-Verhalten beeinträchtigten, wurden die erste und zweite Hälfte der Zeitrafferreihe separat analysiert und die entsprechende Wachstumsgeschwindigkeit und Dynamik verglichen.
Wie erwartet wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Es ist wichtig zu bedenken, dass, da die Zellen in Prometaphase synchronisiert sind, die Dichte der Mikrotubuli sehr hoch ist. Daher muss man die Parameter der Analyse sehr sorgfältig einstellen, um verschiedene Mikrotubuli nicht falsch zu identifizieren.
Die Messung der Mikrotubuli-Dynamik mit dieser Methode kann mit Studien anderer biologischer Targets direkt, indirekt, regulierend Mikrotubuli verglichen werden.
