Dieses Protokoll ermöglicht es CSF und Blutentnahme in der quantitativen Korrektur des CSF-Proteinspiegels, um in Mausmodellen von neurologischen Störungen zu einer Thecal-Proteinsynthese zu messen. Dieses Verfahren bietet eine Ausgangsbasis, anhand derer der pathophysiologische Ursprung von CSF-Proteinen von Interesse und die Stabilität und funktionelle Bedeutung der Integrität des Blutes CSF bewertet werden können. Die Analyse der interthekalen Proteinsynthese und Barriereintegrität kann auf andere Tiermodelle und Studien am Menschen angewendet werden.
Zum Beispiel, um auf Krankheiten des zentralen Nervensystems zu überprüfen. Das Sammeln signifikanter Mengen an sauberem CSF kann bei Mäusen technisch schwierig sein, so dass die Technik so lange geübt wird, bis große Mengen an nicht kontaminierten Proben gewonnen werden können. Demonstriert wird die Verfahren von Micheal Linzey, einem Grad-Studenten des Studiengangs experimentelle und molekulare Medizin in Dartmouth, in unserer neuen Forschungsgruppe Immunologie.
Zur Serumsammlung über retroorbitale Blutungen. Nachdem Sie eine mangelnde Reaktion auf Pedalreflexe in einer mehr als 15 Gramm beästheten Maus bestätigt haben, greifen Sie die lockere Haut hinter den Ohren mit dem Daumen und Zeigefinger der nicht-dominanten Hand und verwenden Sie den Zeigefinger, um die Haut über den Augen zurückzuziehen. Mit dem Daumen, um die Haut unter den Augen zurückzuziehen, legen Sie die Spitze einer Pasteur Pipette, die in einem etwa 45-Grad-Winkel gehalten wird, in die Augenhöhle unter dem Augapfel, in Richtung der Mitte der Augenhöhle gerichtet, während sie die Pipette zwischen den Fingern dreht.
Dann kurz, sanften Druck und Loslassen, damit Blut in die Pipette gelangen. Wenn die Blutprobe entnommen wurde, entfernen Sie vorsichtig die Kapillare, ohne das Auge zu verletzen, und übertragen Sie das Blut in ein 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr. Nach dem Schließen des Augenlids, wenden Sie leichten Druck mit Gaze, um weitere Blutungen zu verhindern.
Lassen Sie das Blut 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur gerinnen, bevor Sie die Probe durch Zentrifugation nach unten drehen. Mit einer sauberen Pipettentechnik das abgetrennte Serum in eine neue, beschriftete 500-Mikroliter-Durchstechflasche einsammeln und das Serum sofort bei 80 Grad Celsius einfrieren. Nach der Bestätigung der fehlenden Reaktion auf Pedalreflex, entfernen Sie eine große genug Fläche der Haare, um die Sammlung der zerebralen Rückenmarksflüssigkeit sofort am kaudalen Ende des Schädels der anästhesierten Maus zu ermöglichen.
Legen Sie die Maus in eine anfällige Position auf einem stereotaxic Gerät unter sterilen Bedingungen, und stabilisieren Sie den Kopf mit Ohrbügeln. Wischen Sie die chirurgische Stelle mit 30% Chlorhexidin-Diacetat, und machen Sie einen sagittalen Hautschnitt schlechter als der Okziput, um die Muskeln über der Zisternen magna auszusetzen. Mit Zangen, stumpf sezieren das subkutane Gewebe und Muskeln, und verwenden Mikro-Retraktoren, um die Muskeln auseinander zu halten, um die Dura mater Meningealschicht über der Cisterna magna auszusetzen.
Waschen Sie das Gewebe vorsichtig mit sterilem PBS, um eine mögliche Blutkontamination zu entfernen, und verwenden Sie einen sterilen Wattestäbchen, um die Dura mater trocken zu machen. Die Positionierung der anfänglichen Punktion an der Zisterne magna ist wichtig, um reichliches, nicht kontaminiertes CSF zu erhalten. Mit einer 30-Spur-Nadel, sanft punktieren Sie die Membran, die die Zisterne magna bedeckt, und setzen Sie schnell und sanft ein kleines Glaskapillarrohr in die Punktion.
Wenn fünf bis zwölf Mikroliter CSF gesammelt wurden, entfernen Sie vorsichtig das Rohr aus der Membran und verwenden Sie ein Stück Polyethylenschläuche, um das Rohr mit einer Drei-Milliliter-Spritze zu verbinden. Injizieren Sie das gesammelte CSF in eine beschriftete 500-Mikroliter-Röhre auf Eis und verwenden Sie eine Einwegnadel und verschiedene Polydioxanon-Nähte, um den Schnitt zu schließen. Reinigen Sie den Bereich von getrocknetem Blut oder Gewebe, und legen Sie die Maus in einen sauberen, warmen Käfig mit Überwachung bis zur vollen Recumbency.
Sammeln Sie das CSF durch Zentrifugation, und überprüfen Sie das Pellet visuell und überlagern Sie es auf Anzeichen einer Blutkontamination. Dann mit sauberer Pipettentechnik, übertragen Sie das CSF-haltige Supernate in ein neues 200-Mikroliter-Rohr, und verdünnen Sie das CSF im Verhältnis eins zu drei mit PBS für die sofortige Lagerung bei 80 Grad Celsius. Für die Serumsammlung durch Herzpunktion, unmittelbar nach der CSF-Sammlung, wie gerade gezeigt, legen Sie die Maus in die Supine-Position.
Die Bauchhaut mit 70% Alkohol abwischen. Verwenden Sie eine Schere, um die Brusthöhle zu öffnen, das Herz freizulegen, und legen Sie eine 25-Spur-Nadel, die an einer 3-Milliliter-Spritze befestigt ist, in den linken Ventrikel ein. Dann tragen Sie vorsichtig Unterdruck auf den Spritzenkolben auf und ziehen Sie die Nadel zurück, nachdem das Blut entnommen wurde.
Drücken Sie den Kolben, um das gesammelte Blut in eine 1,5 Milliliter-Durchstechflasche zu werfen. Lassen Sie nun das Blut 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur gerinnen, bevor Sie das Serum durch Zentrifugation trennen. Dann, mit einer sauberen Pipetten-Technik, übertragen Sie das Serum in eine neue beschriftete 500 Mikroliter Durchstechflasche für die sofortige Lagerung bei 80 Grad Celsius.
Um die Zielproteine und Albumen in übereinstimmenden Serum- und CSF-Proben zu quantifizieren, verwenden Sie einen Standard-Protein-Quantifizierungstest, bei dem referenzierte Standardproteine eine Standardkurve für jedes Protein von Interesse erstellt werden. Exportieren Sie nach der Analyse die Rohdaten in ein geeignetes Software-Graphikprogramm, und zeigen Sie die Erkennungssignalfluoreszenzintensität im Vergleich zu den Standardproteinkonzentrationen, um eine Standardkurve für jedes Protein von Interesse zu erstellen. Verwenden Sie dann die Standardkurven, um die Konzentrationen jedes Analyten von Interesse in den Proben zu berechnen.
Verwenden Sie schließlich Albumen- und Zielanalytkonzentrationen, um Q-Werte und intrathekalen Index zu berechnen. Die tatsächlichen Konzentrationen des gesamten IgG sind im CSF von zwei getesteten Nagetiermodellen der Multiplen Sklerose signifikant erhöht, verglichen mit den entsprechenden altersgerechten Scheinkontrollen. R-EAE-Mäuse zeigen signifikant verbesserte Albumenquotientenwerte, was auf eine erhöhte Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke bei diesen Mäusen hindeutet.
Umgekehrt gibt es keine Unterschiede im Albumenquotienten zwischen TMEV-IDD und Scheinmäusen, was frühere Befunde einer intakten Barriere bei TMEV-IDD-Mäusen bestätigt. Darüber hinaus werden bei TMEV-IDD-Tieren deutlich höhere IgG-Indexwerte und damit eine intrathekale IgG-Produktion beobachtet. Die Berechnung eines Proteinindex erleichtert die Identifizierung neuartiger Protein-Biomarker, die für die Frühdiagnose, Ergebnisvorhersage und Krankheitsverlaufsüberwachung sowohl bei neuroentzündlichen als auch bei neurodegenerativen Erkrankungen nützlich sind.
