Этот протокол позволяет CSF и сбор крови в количественной коррекции уровней белка CSF для измерения в синтезе этиального белка в мышиных моделях неврологических расстройств. Эта процедура обеспечивает базовый уровень, на основе которого можно оценить патофизиологическое происхождение белков CSF, представляющих интерес, а также стабильность и функциональную значимость целостности пользу CSF крови. Анализ межтекального синтеза белка и барьерной целостности может быть применен к другим моделям животных и исследованиям человека.
Например, проверить на наличие заболеваний центральной нервной системы. Сбор значительных объемов чистого CSF может быть технически сложным у мышей, поэтому практикует технику до тех пор, пока большие объемы незагрязнено образца могут быть получены рекомендуется. Демонстрация процедур будет Майкл Linzey, аспирант из программы в экспериментальной и молекулярной медицины в Дартмуте, в нашей новой исследовательской группы иммунологии.
Для сбора сыворотки с помощью ретро орбитального кровотечения. После подтверждения отсутствия ответа на педаль рефлекс в более чем 15 грамм анестезированный мыши, схватить свободную кожу за ушами с большим и указательным пальцем не доминирующей рукой, и использовать указательный палец, чтобы оттянуть кожу над глазами. Используя большой палец, чтобы оттянуть кожу под глазами, поместите кончик пипетки Pasteur, удерживаемый под углом примерно 45 градусов, в глазницу под глазным яблоком, направленную к середине глазницы, вращая пипетку между пальцами.
Затем нанесите краткое, мягкое давление и отпустите, чтобы кровь вошел в пипету. Когда образец крови был собран, осторожно удалить капилляр, не повреждая глаз, и передать кровь в 1,5 миллилитр центрифуги трубки. После закрытия век нанесите мягкое давление марлей, чтобы предотвратить дальнейшее кровотечение.
Разрешить крови сгусток в течение 30 до 60 минут при комнатной температуре, прежде чем спиннинг вниз образца центрифугации. Используя чистую технику пипетки, соберите разделенную сыворотку в новый, помеченный 500 микролитровый флакон, и немедленно заморозить сыворотку при 80 градусах по Цельсию. После подтверждения отсутствия реакции на педаль рефлекс, удалить достаточно большой площади волос, чтобы сбор спинномозговой жидкости непосредственно на хвостовой части черепа обезболивающей мыши.
Поместите мышь в положение, подверженное стереотаксису, в стерильных условиях и устоичивую голову ушными прутьями. Шваб хирургического сайта с 30%хлоргексидина диацетата, и сделать sagittal разрез кожи уступает occiput подвергать мышцы чрезмерно цистерна magna. Используя миппы, тупой вскрыть подкожной ткани и мышц, и использовать микро-ретракторы держать мышцы друг от друга, чтобы разоблачить dura mater менингеальный слой над цистерна magna.
Аккуратно мыть ткани стерильными PBS, чтобы удалить любые возможные загрязнения крови, и использовать стерильный ватный тампон, чтобы смыть dura mater сухой. Позиционирование первоначального прокола на цистерна магна имеет важное значение для получения обильных, не загрязненных CSF. Используя 30-го калибра иглы, осторожно проколоть мембрану, покрывающую цистерна magna, и быстро и осторожно вставить небольшую стеклянную капиллярную трубку в прокол.
Когда 5 до 12 микролитров CSF были собраны, тщательно удалить трубку из мембраны и использовать кусок полиэтиленовой трубки для подключения трубки к три миллилитров шприца. Введи собранный CSF в помеченную 500 микролитровую трубку на льду, и используйте одноразовую иглу и разнообразные шовы полидиоксанона, чтобы закрыть разрез. Очистите область любой высохшей крови или ткани, и поместите мышь в чистую, теплую клетку с мониторингом до полного лежачих.
Соберите CSF путем центрифугации, и визуально проверить гранулы и загнеть его на наличие каких-либо признаков загрязнения крови. Затем с помощью чистой техники пипетки, передать CSF-содержащих супернат в новую трубку 200 микролитров, и разбавить CSF на один-три соотношения с PBS для немедленного хранения при 80 градусов по Цельсию. Для сбора сыворотки путем сердечного прокола, сразу после сбора CSF, как только что продемонстрировано, поместите мышь в положение на спине.
Шваб брюшной кожи с 70% алкоголя. Используйте ножницы, чтобы открыть грудной полости, подвергая сердце, и вставить 25 калибровочных иглы прилагается к 3 миллилитров шприц в левый желудочек. Затем осторожно нанесите отрицательное давление на поршень шприца, снятия иглы после того, как кровь была собрана.
Депрессия поршень, чтобы извлечь собранную кровь в 1,5 миллилитров флакона. Теперь, позвольте крови сгусток в течение 30 до 60 минут при комнатной температуре, прежде чем отделить сыворотку центрифугации. Затем, используя чистую технику пипетки, перенесите сыворотку в новый флакон с маркировкой 500 микролитров для немедленного хранения при 80 градусах Цельсия.
Для количественной оценки целевых белков и альбумена в образцах сыворотки и CSF используйте стандартный анализ количественной оценки белка, используя эталонные стандартные белки для подготовки стандартной кривой для каждого интересного белка. После анализа экспорт необработанных данных в соответствующую программную программу графикирования и график интенсивности сигнала обнаружения по сравнению со стандартными концентрациями белка для создания стандартной кривой для каждого интересного белка. Затем используйте стандартные кривые для расчета концентраций каждого аналита, представляющих интерес в образцах.
Наконец, используйте альбумен и целевые концентрации аналита для расчета значений и внутритекального индекса. Фактические уровни общего IgG значительно увеличены в CSF двух испытанных моделей грызунов рассеянного склероза, по сравнению с соответствующим возрастом соответствует фиктивный контроль. R-EAE мышей показывают значительно расширенные значения коэффициента альбумена, что свидетельствует о повышенной проницаемости геммоэнцефалический барьер у этих мышей.
Но, на обратной стороне, между TMEV-IDD и фиктивными мышами нет различий в факторе альбумена, что подтверждает предыдущие выводы о нетронутом барьере у мышей TMEV-IDD. Кроме того, у животных ТМЭВ-IDD наблюдаются значительно более высокие значения индекса IgG и, следовательно, внутритекалионные igG-производства. Расчет белкового индекса облегчает выявление новых белковых биомаркеров, полезных для ранней диагностики, прогнозирования исходов и мониторинга курса заболеваний как для нейровоспламеняющихся, так и для нейродегенеративных заболеваний.
