マウスにおけるインテコール内合成タンパク質の定量測定

このプロトコルは、CSFタンパク質レベルの定量的補正におけるCSFおよび血液採取を、神経疾患のマウスモデルにおける表層タンパク質合成に測定することを可能にする。この手順は、対象となるCSFタンパク質の病態生理学的起源に対するベースラインを提供し、血液CSFの安定性および機能的意義を評価することができる。インターテカルタンパク質合成とバリア完全性の解析は、他の動物モデルやヒト研究にも応用できます。

例えば、中枢神経系の疾患をチェックする。大量のクリーンなCSFを採取することは、マウスでは技術的に困難な場合があるため、大量の汚染されていないサンプルが得られるまでこの技術を実践することをお勧めします。この手順のデモンストレーションは、ダートマスの実験および分子医学のプログラムの卒業生であるMicheal Linzeyが、新しい免疫学研究グループで行われます。

レトロ眼窩出血による血清収集用。15グラム以上の麻酔マウスでペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、非支配的な手の親指と人差し指で耳の後ろの緩い皮膚をつかみ、人差し指を使って目の上の皮膚を引き戻す。親指を使って目の下の皮膚を引き戻し、約45度の角度で保持されたパスツールピペットの先端を眼球の下の眼窩に置き、指の間でピペットを回転させながら眼窩の真ん中に向けます。

その後、短い、穏やかな圧力を適用し、血液がピペットに入ることができるように解放します。血液サンプルを採取したら、眼を傷つけずに毛細血管を静かに取り出し、血液を1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。まぶたを閉じた後、ガーゼで軽い圧力をかけて、さらなる出血を防ぎます。

血液を室温で30〜60分間凝固させ、遠心分離によってサンプルを回転させます。きれいなピペット技術を使用して、分離した血清を新しい500マイクロリットルバイアルに集め、すぐに80°Cで血清を凍結します。ペダル反射への応答の欠如を確認した後、麻酔マウスの頭蓋骨の尾端ですぐに脳脊髄液の収集を可能にする十分な大きさの毛髪の領域を取り除く。

無菌状態下で立体的なデバイス上の傾向のある位置にマウスを置き、耳の棒で頭を安定させます。30%クロルヘキシジンジアセテートで手術部位をスワブし、シスターナマグナの上にある筋肉を露出させるために咬合部に劣る矢状皮膚切開を行う。鉗子を使用して、皮下組織と筋肉を鈍く解剖し、マイクロリトラクターを使用して筋肉を離れて保持し、システルナマグナの上に硬膜メナーメニンゲアル層を露出させる。

滅菌PBSで組織を静かに洗い、血液汚染の可能性を取り除き、滅菌綿棒を使用してデュラマーターを乾燥させます。システルナマグナでの最初の穿刺の位置を決めることは、豊富な非汚染CSFを得るために不可欠です。30ゲージの針を使用して、水槽マグナを覆う膜を軽く穿刺し、小さなガラス毛細管を穿刺に素早くそっと挿入します。

5~12マイクロリットルのCSFを採取した場合は、膜からチューブを慎重に取り出し、ポリエチレンチューブを使用してチューブを3ミリリットルのシリンジに接続します。採取したCSFを氷上の標識された500マイクロリットルチューブに注入し、使い捨て針と様々なポリジオキサノン縫合糸を使用して切開を閉じます。乾燥した血液または組織の領域をきれいにし、完全な再発まで監視して清潔で暖かいケージにマウスを置きます。

遠心分離によってCSFを収集し、目視でペレットを検査し、血液汚染の兆候のためにそれを上華。その後、クリーンピペット技術を使用して、CSF含有スーパーネイトを新しい200マイクロリットルチューブに移し、CSFをPBSと1〜3の比率で希釈し、摂氏80度で即時保存します。心臓穿刺による血清採取については、CSF採取直後に、ちょうど実証したように、マウスをsupineの位置に置く。

70%アルコールで腹部の皮膚をスワブ。はさみを使用して胸腔を開き、心臓を露出させ、3ミリリットルの注射器に取り付けられた25ゲージの針を左心室に挿入する。その後、注射器プランジャーに優しく負圧を加え、血液が採取された後に針を引き出します。

プランジャーを押し下げて、収集した血液を1.5ミリリットルのバイアルに排出します。今度は、遠心分離によって血清を分離する前に、室温で30〜60分間血液を凝固させる。次に、きれいなピペット技術を使用して、血清を新しいラベル付き500マイクロリットルバイアルに移し、摂氏80度で即時保管します。

一致した血清およびCSF検体における標的タンパク質およびアルブミンを定量するには、標準タンパク質定量アッセイを使用し、参照された標準タンパク質を使用して、対象となる各タンパク質の標準曲線を調製する。分析後、生データを適切なソフトウェアグラフプログラムにエクスポートし、検出シグナル蛍光強度と標準タンパク質濃度をグラフ化し、目的の各タンパク質の標準曲線を作成します。次に、標準曲線を使用して、サンプル内の対象の各分析対象の濃度を計算します。

最後に、アルブミンと標的検体濃度を使用して、Q値と内部のthecalインデックスを計算します。総IgGの実際のレベルは、対応する年齢と一致したシャムコントロールと比較して、多発性硬化症の2つの試験済げ歯類モデルのCSFで有意に増加している。R-EAEマウスは有意に増強されたアルブミン商値を示し、これらのマウスにおける血液脳関門の透過性の増加を示す。

逆に、TMEV-IDDとシャムマウスの間にアルブミン商の違いはなく、TMEV-IDDマウスにおける無傷の障壁の以前の知見を裏付ける。また、TMEV-IDD動物では、著しく高いIgG指数値が、したがって、インテムカルIgG産生が観察される。タンパク質指標の計算は、神経炎症性疾患および神経変性疾患の両方の早期診断、結果予測、および疾患経過モニタリングに有用な新規タンパク質バイオマーカーの同定を促進する。