Биоинформатика является полезным способом извлечения информации из наборов данных. Эксперименты не менее важны для проверки. Мы объединяем оба подхода для исследования роли выемки сигнализации при раке яичников.
Основным преимуществом этого метода является то, что исследователи могут использовать информацию из баз данных биоинформатики для планирования своего направления исследований до проведения эксперимента. С накопленными биоинформатиками данных о болезнях человека, ученые больше не с завязанными глазами. Эксперименты могут быть выполнены для проверки конкретных выводов, которые могут привести к улучшению терапии или диагностики заболеваний.
Для мета-анализа связи гена, представляющих интерес, с определенным типом рака, создайте учетную запись с аффилированным с академией адресом электронной почты для доступа к базе данных PRECOG и введите адрес электронной почты и пароль, связанный с учетной записью, в терминал входа. Нажмите Просмотреть детали и ввести ген интереса в поле поиска. Затем используйте бар прокрутки, чтобы получить оценку выживаемости для конкретного типа рака.
Чтобы исследовать связь между уровнями экспрессии генов и стадиями рака яичников, перейдите на веб-страницу CSIOVDB и вещите название гена, представляющий интерес, в планку поиска. Затем нажмите на вкладку выживания. Чтобы оценить данные экспрессии генов в различных, нормальных и опухолевых тканях, перейдите на портал GENT и нажмите кнопку Поиск.
В разделе ключевых слов выберите символ гена для терминов из меню высадки, вемите символ гена, представляющий интерес, и выберите Ткань для варианта типа. Нажмите кнопку Поиска. Будут отображаться сводные графики экспрессии генов в нормальных и опухолевых тканях различных типов рака, основанные на платформах U133A и U122 Plus 2.
Затем нажмите на ссылку Result Data Download, чтобы получить доступ к подробной информации о значениях экспрессии генов, типах тканей и источниках данных. Для поиска генетических изменений и сигнальных сетей откройте веб-страницу портала CBIO и с помощью запроса на странице посадки щелкните органы или ткани, представляющие интерес, в разделе Select Studies, выберите конкретное исследование, представляющие интерес, и нажмите Запрос по Джину. В разделе «Выберите геномные профили» выберите мутации, изменения числа копий из GISTIC или вариант экспрессии мРНК.
Выберите соответствующие данные из меню Select Patient/Case Set и введите символы целевого гена в поле запросов Enter Genes. Нажмите кнопку Отправка запроса и откройте вкладку Network, чтобы получить нужную сеть генов. Затем нажмите на вкладку Файл и выберите Save As Image PNG для загрузки сетевого изображения.
Чтобы создать мух с NICD или NICD и mam overexpression, подготовить соответствующие запасы мух, а также применить временные и региональные методы экспрессии генов ориентации для контроля экспрессии spatiotemporal гена, в соответствии со стандартными протоколами. Поднимите мух на 18 градусов по Цельсию до совершеннолетия, прежде чем перейти на 29 градусов по Цельсию с дрожжами в течение 48 часов. В конце инкубации 29 градусов по Цельсию добавьте три миллилитров PBS в блюдо для сбора эмбрионов и обезболить культуру мух с помощью прокладки с углекислым газом.
Используйте рассечение микроскопа для выявления анестезированой самки мухи, и использовать пару рассечения типсов, чтобы тщательно захватить нижнюю грудную клетку мухи. Погрузите муху в PBS в блюдо сбора эмбрионов, и использовать вторую пару щипся, чтобы ущипнуть нижнюю часть живота, потянув осторожно освободить внутренние органы. Найдите и отсоедините пару яичников от тела мухи, и разбей мышечную оболочку, расположенную на заднем конце яичников, чтобы отделить яичники.
Затем поместите изолированные яичники в 1,5 миллилитровую центрифугу, содержащую 500 микролитров PBS на льду. Когда все яичники были собраны, заменить PBS с 500 микролитров 4%формальдегида, и поместите трубку на nutator в течение 10 минут. В конце инкубации, отбросить фиксатор и мыть яичники с тремя, 15-минутные полоскания в один миллилитр PBT за стирку.
После последней стирки, этикетка яичников с 150 микролитров 10 микрограмм на миллилитр DAPI в течение 10-15 минут на nutator. В конце инкубации, мыть яичники один раз в течение 10 минут с одним миллилитров PBT, а затем два 10-минутных моет в PBS. После второй стирки, удалить все, кроме последних 300 микролитров PBS, и использовать 200 микролитер пипетки отзыв банально яичников несколько раз, чтобы освободить яичные камеры.
Далее, осторожно осадок ткани яичников через быстрый спин в микроцентрифуге, и удалить как можно больше PBS, как это возможно, не нарушая гранулы яичников. Используя 1000 микролитровый наконечник пипетки, перенесите около трех капель монтажного раствора в трубку и используйте 200 микролитровых пипеток с примерно 0,33 миллиметра, подстриженных от конца, чтобы перенести все 120 микролитров яичников, содержащих монтажный раствор, на слайд стеклянного микроскопа. Аккуратно поместите стекло крышки на монтажный раствор и запечатайте края прозрачным лаком для ногтей.
Затем используйте конфокальный микроскоп при 10-х увеличении с диафрагмой 0,8, чтобы получить изображения окрашенных и установленных яичников. Используя портал PRECOG, как попродемонстрировано, можно получить баллы NOTCH2, NOTCH3 и MAML1 при раке яичников. Отрицательные значения оценки указывают на плохое общее выживание пациентов с высоким уровнем экспрессии трех генов.
Использование базы данных CSIOVD для подтверждения этих выводов также указывает на то, что высокое выражение NOTCH2, NOTCH3 и MAML1 коррелирует с плохим общим и свободным от болезней выживанием. Дальнейшие тесты на перестановку показывают, что NOTCH2, NOTCH3 и MAML1 высоко выражены в опухолевых тканях. Основываясь на этих трех основных генах, сигнальная сеть может быть создана, чтобы обеспечить 50 наиболее часто изменяемых соседних генов, которые также находятся в том же пути с самыми высокими показателями мутаций.
Интерес представляет переэкспрессия гена НОТЧ, эквивалентного drosophila, NICD, сама по себе не вызывает опухолей в Дрозофиле. В то время как переэкспрессия NICD и mam вместе вызывает опухоли у плодовых мушек, о чем свидетельствует наличие нескольких эпителиальных слоев и накопленных клеток. Дальнейшая проверка экспериментов может проложить путь для выявления потенциальных новых целей медикаментозной терапии, биомаркеров болезней и персонализированного лечения.
