La bioinformatica è un modo utile per estrarre informazioni dai set di dati. La sperimentazione è altrettanto importante per la convalida. Combiniamo entrambi gli approcci per indagare il ruolo della segnalazione della tacca nel cancro alle ovaie.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che i ricercatori possono utilizzare le informazioni dei database di bioinformatica per pianificare la loro direzione di ricerca prima di condurre un esperimento. Con i dati bioinformatici accumulati sulle malattie umane, gli scienziati non sono più bendati. La sperimentazione può essere eseguita per convalidare risultati specifici, che possono portare a terapie migliorate o diagnosi di malattie.
Per l'analisi meta-A dell'associazione di un gene di interesse con un tipo specifico di tumore, creare un account con un indirizzo email affiliato all'accademico per accedere al database PRECOG e inserire l'indirizzo e-mail e la password associati all'account nel terminale di accesso. Fare clic su Visualizza dettagli e immettere il gene di interesse nella barra di ricerca. Quindi usa la barra di scorrimento per ottenere il punteggio Z di sopravvivenza per il tipo specifico di interesse del cancro.
Per indagare l'associazione tra i livelli di espressione genica e le fasi del cancro alle ovaie, passare alla pagina web di CSIOVDB e inserire il nome del gene di interesse nella barra di ricerca. Quindi fai clic sulla scheda Sopravvivenza. Per valutare i dati dell'espressione genica tra tessuti diversi, normali e tumorali, passare al portale GENT e fare clic sulla scheda Cerca.
Nella sezione delle parole chiave, selezionare il simbolo genico per i termini dal menu a discesa, inserire il simbolo del gene del gene di interesse e selezionare Tessuto per l'opzione tipo. Fare clic sul pulsante Cerca. Verranno visualizzati grafici riassuntiri dell'espressione genica nei tessuti normali e tumorali di diversi tipi di cancro, basati sulle piattaforme U133A e U122 Plus 2.
Quindi fare clic sul collegamento Download dati risultato per accedere alle informazioni dettagliate sui valori dell'espressione genica, sui tipi di tessuto e sulle origini dati. Per cercare alterazioni genetiche e reti di segnalazione, aprire la pagina web del portale CBIO e, utilizzando la query nella pagina di destinazione, fare clic sugli organi o sui tessuti di interesse nella sezione Seleziona studi, selezionare il particolare studio di interesse e fare clic su Query by Gene. Nella sezione Seleziona profili genomici selezionare le mutazioni, le alterazioni putative del numero di copia da GISTIC o l'opzione di espressione dell'mRNA.
Selezionare i dati corrispondenti dal menu Seleziona set di pazienti/casi e immettere i simboli gene di destinazione nella casella di query Immettere geni. Fare clic sul pulsante Invia query e aprire la scheda Rete per recuperare la rete genica desiderata. Quindi fare clic sulla scheda File e selezionare Salva come immagine PNG per il download di immagini di rete.
Per creare mosche con sovraespressione NICD o NICD e mam, preparare le scorte di mosca appropriate e applicare la tecnica di targeting dell'espressione genica temporale e regionale per controllare l'espressione genica spatiotemporale, secondo protocolli standard. Alza le mosche a 18 gradi Celsius fino all'età adulta, prima di passare a 29 gradi Celsius con lievito per 48 ore. Alla fine dell'incubazione di 29 gradi Celsius, aggiungere tre millilitri di PBS a un piatto di raccolta degli embrioni e anestetizzare la coltura della mosca con un cuscinetto di anidride carbonica.
Utilizzare un microscopio sezionante per identificare una mosca femminile anestetizzata e utilizzare un paio di forcep sezionanti per afferrare attentamente il torace inferiore della mosca. Immergere la mosca nel PBS all'interno del piatto di raccolta dell'embrione e utilizzare un secondo paio di forcep per pizzicare l'addome inferiore, tirando delicatamente per rilasciare gli organi interni. Individuare e staccare la coppia di ovaie dal corpo della mosca e rompere la torcia muscolare, situata all'estremità posteriore delle ovaie, per separare le ovaie.
Quindi posizionare le ovaie isolate in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri, contenente 500 microlitri di PBS sul ghiaccio. Una volta raccolte tutte le ovaie, sostituire il PBS con 500 microlitri di formaldeide al 4% e posizionare il tubo su un nutator per 10 minuti. Alla fine dell'incubazione, scartare il fissatore e lavare le ovaie con tre risciacqui di 15 minuti in un millilitro di PBT per lavaggio.
Dopo l'ultimo lavaggio, etichettare le ovaie con 150 microlitri da 10 microgrammi per millilitro DAPI per 10-15 minuti sul nutator. Alla fine dell'incubazione, lavare le ovaie una volta per 10 minuti con un millilitro di PBT, seguito da due lavaggi di 10 minuti in PBS. Dopo il secondo lavaggio, rimuovere tutti gli ultimi 300 microlitri di PBS e utilizzare una punta di pipetta da 200 microlitri per triteare più volte le ovaie per liberare le camere delle uova.
Successivamente, sedimentare delicatamente il tessuto ovarico attraverso un rapido giro in un microcentrifugo e rimuovere il più PBS possibile senza disturbare il pellet d'ovaio. Utilizzando una punta di pipetta da 1.000 microliter, trasferire circa tre gocce di soluzione di montaggio sul tubo e utilizzare una punta della pipetta da 200 microlitri con circa 0,33 millimetri tagliati dall'estremità per trasferire l'intero 120 microlitri di soluzione di montaggio contenente ovaie su uno scivolo al microscopio di vetro. Posizionare delicatamente un vetro coverslip sulla soluzione di montaggio e sigillare i bordi con smalto trasparente.
Quindi utilizzare un microscopio confocale con un ingrandimento 10x con un'apertura 0.8 per acquisire immagini delle ovaie macchiate e montate. Utilizzando il portale PRECOG come dimostrato, è possibile ottenere i punteggi Z di NOTCH2, NOTCH3 e MAML1 nel cancro alle ovaie. I valori negativi del punteggio Z indicano la scarsa sopravvivenza complessiva dei pazienti con alti livelli di espressione dei tre geni.
Utilizzando il database CSIOVD per confermare questi risultati, indica inoltre che un'alta espressione di NOTCH2, NOTCH3 e MAML1 è correlata a una scarsa sopravvivenza complessiva e priva di malattie. Ulteriori test di permutazione suggeriscono che NOTCH2, NOTCH3 e MAML1 sono altamente espressi nei tessuti tumorali. Sulla base di questi tre geni principali, è possibile creare una rete di segnalazione per fornire i 50 geni vicini più frequentemente alterati che si trovano anche nella stessa via con i più alti tassi di mutazione.
Di interesse, la sovraespressione del gene NOTCH equivalente alla Drosophila, NICD, da solo, non induce tumori nella Drosophila. Mentre la sovraespressione di NICD e mam insieme induce tumori nei moscerini della frutta, come evidenziato dalla presenza di più strati epiteliali e cellule accumulate. Un'ulteriore convalida della sperimentazione può aprire la strada all'identificazione di potenziali nuovi obiettivi terapeutici farmacologici, biomarcatori di malattie e trattamenti personalizzati.
