Bioinformática é uma maneira útil de extrair informações de conjuntos de dados. A experimentação é igualmente importante para validação. Combinamos ambas as abordagens para investigar o papel da sinalização de entalhe no câncer de ovário.
A principal vantagem dessa técnica é que os pesquisadores podem utilizar as informações das bases de dados de bioinformática para planejar sua direção de pesquisa antes de realizar um experimento. Com dados bioinforáticos acumulados de doenças humanas, os cientistas não estão mais vendados. A experimentação pode ser realizada para validar achados específicos, o que pode levar a terapias melhoradas ou diagnóstico de doenças.
Para analisar meta-A a associação de um gene de interesse com um tipo específico de câncer, crie uma conta com um endereço de e-mail afiliado ao acadêmico para acessar o banco de dados PRECOG e digite o endereço de e-mail e senha associados à conta no terminal de login. Clique em Exibir detalhes e insira o gene de interesse na barra de pesquisa. Em seguida, use a barra de rolagem para obter a pontuação Z de sobrevivência para o tipo específico de câncer de interesse.
Para investigar a associação entre os níveis de expressão genética e os estágios de câncer de ovário, navegue até a página web do CSIOVDB e insira o nome do gene de interesse na barra de pesquisa. Em seguida, clique na guia Sobrevivência. Para avaliar os dados de expressão genética em diferentes tecidos diversos, normais e tumorais, navegue até o portal GENT e clique na guia Pesquisar.
Na seção palavra-chave, selecione o símbolo genético para os termos do menu suspenso, insira o símbolo do gene do gene de interesse e selecione Tecido para a opção tipo. Clique no botão Pesquisar. Gráficos sumários da expressão genética em tecidos normais e tumorais de diferentes tipos de câncer, baseados nas plataformas U133A e U122 Plus 2 serão exibidos.
Em seguida, clique no link De Download de Dados de Resultados para acessar as informações detalhadas sobre os valores de expressão genética, tipos de tecido e fontes de dados. Para procurar alterações genéticas e redes de sinalização, abra a página web do portal do CBIO e use a consulta na página de entrada, clique nos órgãos ou tecidos de interesse na seção Selecionar estudos, selecione o estudo particular de interesse e clique em Consulta por Gene. Na seção Select Genomic Profiles, selecione as mutações, alterações de número de cópias putativas da opção GISTIC ou de expressão mRNA.
Selecione os dados correspondentes no menu Selecionar nomeia paciente/caso e insira os símbolos de gene de destino na caixa de consulta de Enter Genes. Clique no botão Enviar consulta e abra a guia Rede para recuperar a rede genética desejada. Em seguida, clique na guia Arquivo e selecione Salvar Como Imagem PNG para download de imagens de rede.
Para criar moscas com NICD ou NICD e superexpressão de mam, prepare os estoques de moscas apropriados e aplique a técnica de segmentação de expressão genética temporal e regional para controlar a expressão genética espacial, de acordo com os protocolos padrão. Levante as moscas a 18 graus Celsius até a idade adulta, antes de mudar para 29 graus Celsius com levedura por 48 horas. No final da incubação de 29 graus Celsius, adicione três mililitros de PBS a um prato de coleta de embriões, e anestesia a cultura da mosca com uma almofada de dióxido de carbono.
Use um microscópio dissecando para identificar uma mosca fêmea anestesiada, e use um par de fórceps dissecando para pegar cuidadosamente o tórax inferior da mosca. Submergir a mosca na PBS dentro do prato de coleta de embriões, e use um segundo par de fórceps para beliscar o abdômen inferior, puxando suavemente para liberar os órgãos internos. Localize e desprende o par de ovários do corpo da mosca, e quebre a baanha muscular, localizada na extremidade posterior dos ovários, para separar os ovários.
Em seguida, coloque os ovários isolados em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro, contendo 500 microliters de PBS no gelo. Quando todos os ovários tiverem sido coletados, substitua o PBS por 500 microlitres de 4% de formaldeído e coloque o tubo em um nutador por 10 minutos. Ao final da incubação, descarte o fixador e lave os ovários com três enxaguas de 15 minutos em um mililitro de PBT por lavagem.
Após a última lavagem, rotule os ovários com 150 microliters de 10 microgramas por DAPI mililitro por mililitro por 10-15 minutos no nutador. No final da incubação, lave os ovários uma vez por 10 minutos com um mililitro de PBT, seguido por duas lavagens de 10 minutos em PBS. Após a segunda lavagem, remova todos, exceto os últimos 300 microliters da PBS, e use uma ponta de pipeta de 200 microliteres para triterar os ovários várias vezes para liberar as câmaras de ovos.
Em seguida, sedimentar suavemente o tecido ovariano através de um giro rápido em um microcentrifuuge, e remover o máximo de PBS possível sem perturbar a pelota de ovário. Usando uma ponta de pipeta de 1.000 microliteres, transfira cerca de três gotas de solução de montagem para o tubo, e use uma ponta de pipeta de 200 microliteres com aproximadamente 0,33 milímetros aparados da extremidade para transferir todos os 120 microlitros de solução de montagem contendo ovário em um microscópio de vidro. Coloque delicadamente um vidro de deslizamento sobre a solução de montagem e sele as bordas com esmalte transparente.
Em seguida, use um microscópio confocal em uma ampliação de 10x com uma abertura de 0,8 para adquirir imagens dos ovários manchados e montados. Utilizando o portal PRECOG como demonstrado, os escores Z de NOTCH2, NOTCH3 e MAML1 no câncer de ovário podem ser obtidos. Os valores negativos de escore Z indicam a baixa sobrevida geral de pacientes com altos níveis de expressão dos três genes.
Usando o banco de dados CSIOVD para confirmar esses achados, indica ainda que uma alta expressão de NOTCH2, NOTCH3 e MAML1 se correlaciona com uma baixa sobrevida geral e livre de doenças. Outros testes de permutação sugerem que NOTCH2, NOTCH3 e MAML1 são altamente expressos em tecidos tumorais. Com base nesses três genes principais, uma rede de sinalização pode ser criada para fornecer os 50 genes vizinhos mais frequentemente alterados que também estão no mesmo caminho com as maiores taxas de mutação.
De interesse, a superexpressão do gene ENT NOTCH equivalente a Drosophila, NICD, sozinho, não induz tumores em Drosophila. Considerando que a superexpressão da NICD e do mam juntos induz tumores em moscas frutíferas, como evidenciado pela presença de múltiplas camadas epiteliais e células acumuladas. Novas validações de experimentação podem abrir caminho para a identificação de potenciais novos alvos de terapia medicamentosa, biomarcadores de doenças e tratamentos personalizados.
