Wir entwickelten eine neuartige Methode zur Aufzeichnung extrazellulärer neuronaler Signale aus dem Gehirn frei schwimmender Fische. Dies öffnet die Tür, um die Neuronen-Mechanismen am Ende des Tages Fischverhalten zu studieren. Diese Methode ist gültig und wasserdicht und ermöglicht daher die Aufnahme, während die Fische frei im Wassertank schwimmen.
Darüber hinaus kann der Aufnahmeort über das eingebaute Mikrolaufwerk gesteuert werden. Tal Zoor-Novoplansky, unser Labortechniker, wird mir helfen, dieses Verfahren zu demonstrieren. Verwenden Sie zum Bau des Gehäuses eine Messingplatte mit Abmessungen von 19 Millimetern mal 29 Millimetern mal einem Millimeter.
Mit zwei 5,5-Millimeter-Schlitzen an den langen Seiten, senkrecht zur Kante. Die Schlitze sollten 6,5 Millimeter von der schmalen Seite entfernt sein. Falten Sie mit einer Zange den Bereich zwischen den Schlitzen auf den langen Seiten nach innen.
Dann falten Sie den unteren Teil nach innen und die obere Seite nach außen, um das Gehäuse zu erhalten. Als nächstes verwenden Sie ein drei Millimeter Dillbit, um Löcher im Mikroantriebsgehäuse für die Schrauben zu machen und die Seiten des Gehäuses zu löten. Verwenden Sie eine feine kreisförmige Datei, um einen kleinen halbkreisförmigen Schlitz an der Unterseite des Gehäuses zu erstellen, der einen Radius von 1,5 Millimetern hat.
Mit einem 1-Millimeter-Bohrer machen Sie ein Loch in der Rückseite des Gehäuses für die Tetrodes. Verwenden Sie zunächst einen Fräser, um ein Drei-Pol-Stück von einem einreihigen männlichen Stift-Header-Streifen abzubrechen. Mit zange ziehen Sie den mittleren Stift heraus.
Als Nächstes schneiden Sie die verbleibenden Stifte mit einem Fräser auf 10 Millimeter Länge. Verwenden Sie einen Bohrer mit der Nummer 65, um ein Loch durch die mittlere Stiftbohrung zu bohren, und verwenden Sie einen doppelten Null-99-Hahn, um ein Gewinde zu bohren. Montieren Sie den Mikroantrieb und die Messingplatten.
Legen Sie eine Schraube durch die erste Messingplatte, durch das Stiftkopfgewinde und dann durch die zweite Messingplatte. Schließlich legen Sie eine Mutter auf die Schraube und ziehen Sie den montierten Mikroantrieb vorsichtig fest. Löten Sie die Stifte zusammen mit den Messingplatten und löten Sie die Mutter zusammen mit der Spitze der Schraube.
Danach löten Sie den Mikroantrieb an vier Stellen an den Seiten der Mikroantriebs-Messingplatten in das Mikroantriebsgehäuse. Mit Epoxidkleber ein sechs Millimeter langes Edelstahlrohr auf den kleinen halbkreisförmigen Schlitz an der Unterseite des Mikroantriebsgehäuses. Kleben Sie ein drei Millimeter langes Edelstahlrohr an den Stiftkopf, so dass es mit dem sechs Millimeter langen Rohr am Gehäuse aufgereiht ist.
Legen Sie die vorbereiteten Silikon- und Polyimidrohre in die beiden Edelstahlrohre ein und kleben Sie sie mit Cyanoacrylatkleber an das am Stiftkopf befestigte Edelstahlrohr. Dann schrauben Sie den Mikroantrieb ganz nach oben und schneiden Sie die überschüssigen Schläuche von oben und unten der beiden Stahlrohre ab. Als nächstes schneiden Sie zwei blanke Silberdrähte mit einem Durchmesser von 75 Mikrometern auf eine Länge von 12 Zentimetern und löten sie sowohl an die Masseverbindung in der Elektrodenschnittstellenplatine als auch an alle ungenutzten Kanäle.
Schieben Sie einen der vorbereiteten Wolframdrähte in eines der Löcher einer 16-Kanal-Elektroden-Schnittstellenplatine. Legen Sie einen Stift in das Loch und drücken Sie ihn mit einer Zange. Messen Sie den Widerstand zwischen dem Stift und der nicht codierten Seite des Drahtes, um die Konnektivität zu überprüfen.
Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle vorbereiteten Drähte, einschließlich eines 50-Mikrometer-Drahtes für Referenzelektrode. Gruppieren Sie dann die Elektrodendrähte in zwei Gruppen von jeweils vier Drähten und verkleben Sie sie mit Klebeband am Ende jedes Drahtes, wobei der Referenzdraht in Ruhe gelassen wird. Halten Sie die Elektrodenschnittstellenplatine über eine motorisierte Drehvorrichtung und legen Sie das Kanalbandende aus einer Gruppe von vier Drähten auf das Gerät.
Tragen Sie 130 Runden im Uhrzeigersinn auf, gefolgt von 20 Drehungen gegen den Uhrzeigersinn. Dann Cyanoacrylatkleber auftragen, um die Tetrode zu bedecken. Nachdem der Kleber ausgehärtet ist, schneiden Sie die Tetrode in der Nähe des Klebebandes.
Wiederholen Sie diesen Dreh-, Klebe- und Schneidprozess auf die andere Tetrode. Befestigen Sie zunächst das Mikroantriebsgehäuse mit zwei Millimeterschrauben an der Loggerbox. Gewinden Sie die Tetroden und die Referenzelektrode durch das Loch an der Rückseite des Mikroantriebsgehäuses.
Fädeln Sie die Tetroden durch die beiden Silikonrohre und fädeln Sie den 50 Mikrometer Wolframdraht durch das Polyimidrohr. Schrauben Sie den Mikro-Tauchgang den ganzen Weg nach unten und tragen Sie Cyanoacrylatkleber auf die Oberseite der Rohre auf, um die Tetrodes und Drähte an ihre Rohre zu kleben und sicherzustellen, dass die Bewegung mit dem Mikroantrieb übereinstimmt. Schrauben Sie den Mikroantrieb bis ganz nach oben.
Tragen Sie weiches Erdöl auf die freiliegende Tetrode und Drähte im Mikroantriebsgehäuse auf, um Bewegung zu verhindern. Befestigen Sie ein vorgeschnittenes Petrischalen-Bodenfenster an der Vorderseite des Mikroantriebsgehäuses mit Epoxid, während Sie sicherstellen, dass die Erddrähte außerhalb des Fensters bleiben. Als Nächstes wenden Sie die Raumtemperatur-Vulkanisationaufstriche auf die freiliegenden Tetrodes und Drähte zwischen der Logger-Box-Abdeckung und dem Microdrive-Gehäuse an.
Verwenden Sie scharfe Schere, um die Tetrodes und Referenzdraht auf die gewünschte Länge zu schneiden. Danach den markierten, ausgestrahlten Polystyrolschaum an der Schachtel befestigen. Passen Sie seine Größe so an, dass sein Auftrieb ausgeglichen ist, wenn er im Wasserbad untergetaucht ist.
Nach der Anästhesisierung der Fische, nehmen Sie die Fische aus dem Wasser und legen Sie es in den Halter. Verwenden Sie einen sterilen Spachtel, um fünf Prozent Lidocainpaste auf die Haut oberhalb der vorgesehenen Operationsstelle für 10 Minuten aufzutragen. Entfernen Sie dann das Lidocain.
Verwenden Sie ein steriles Blattskalpell mit der Nummer 15, um die Haut über dem Schädel in der für das Implantat bestimmten Region zu entfernen. Dann verwenden Sie einen Zahnbohrer mit 0,7-Millimeter-Bohrern, um vier Löcher in den Schädel zu bohren. Cyanoacrylatkleber auf eine der Löcher auftragen und sofort eine Ein-Millimeter-Schraube einsetzen.
Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Bohrungen. Danach verwenden Sie einen Zahnbrand, um Zahnzement auf die Schrauben und an der Peripherie des freiliegenden Schädels aufzutragen. Mit dem Zahnbohrer machen Sie ein Loch, das fünf Millimeter im Durchmesser über dem Hirnbereich von Interesse ist.
Verwenden Sie feine Pinzette und Weichteilpapier, um Fettgewebe zwischen Schädel und Gehirn zu entfernen und das Ziel der Hirnregion zu bedecken, da es darauf achtet, die großen Blutgefäße unter dem Schädel nicht zu beschädigen. Senken Sie zunächst das Implantat so ab, dass die Elektroden in das Gehirn eingeführt werden, während sich der untere Teil des Mikroantriebsgehäuses in der Nähe des Schädels befindet. Beginnen Sie mit der Befestigung des Implantats am Schädel, indem Sie eine kleine Menge Zahnzement zwischen dem Gehäuse und der nächsten Schädelschraube auftragen.
Nach dem ersten Teil des Zahnzementes ist geheilt aufaddition Zahnzement und schließen Sie das Loch über dem Schädel und den gesamten exponierten Schädel. Nachdem Sie die Kiemen des Fisches mit frischem Wasser gespült haben, um ihn zu wecken, entfernen Sie den Fisch aus dem Halter und legen Sie ihn wieder in seinen heimischen Tank. Stellen Sie sicher, dass der Fisch mit dem Implantat frei schwimmen kann.
Das Ziel dieser Experimente ist es zu untersuchen, wie die neuronale Aktivität einzelner Zellen das Verhalten der Fische kodiert. Um dies zu erreichen, wird ein Tetrode-Array in das Telencephalon frei schwimmender Goldfische implantiert, wodurch die neuronale Aktivität aufgezeichnet werden kann. Die Hirnaktivität während der Aufnahme wird bei 31, 250 Hertz digitalisiert und Hochpass mit 300 Hertz durch den Datenlogger gefiltert.
Dann wird offline ein Bannpassfilter auf die Signale angewendet und die vorsortierten Rohdaten werden in den Kanal und den Referenzkanal jedes Tetroden getrennt. Die nächsten gängigen Spike-Sortieralgorithmen werden verwendet, um die Einzelzellaktivität zu charakterisieren. Zunächst wird jeder Kanal manuell nach dem minimalen Spike-Amplitudenschwellenwert gefiltert.
Spikes, die in mehr als einer Tetrode oder im Referenzkanal erschienen sind, werden ebenfalls gefiltert. Die erkannten Spitzen werden dann manuell gruppiert und nach Form, Länge, Interspike-Intervall und Prinzipkomponentenanalyse gefiltert. Es ist wichtig, die Integrität des Implantats vor der Operation zu überprüfen.
Die Tetrode kann mit einem Standard-Impedanzmesser überprüft werden und die Box sollte auf Leckage unter Wasser überprüft werden. Diese Methode kann geändert werden, um mit vielen Wassertieren zu arbeiten, solange sie groß genug sind, um das System zu halten. Dies ermöglicht es, den neuronalen Mechanismus zu studieren, die ihrem Verhalten zugrunde liegen.
