Das folgende Protokoll beschreibt ein System, das gut funktioniert in 20-35 g Mäusen. Das Verfahren könnte problemlos an größeren oder kleineren Mäusen, indem einfach die Kathetergröße. Alle Tier Protokolle wurden von der Johns Hopkins University Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Lung Instillation <ol><li> Wählen Kommerzielle Ein-Zoll-langen 20 g intravenöse Kanüle für die Intubation zu verwenden. </li><li> Ändern die Katheterspitze manuell gebogen wird, um eine leichte Krümmung in der Spitze zu erzeugen, wie in 1 dargestellt. </li><li> Betäuben die Maus mit einem Gemisch aus Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (15 mg / kg) ip injiziert, und bestätigen Anästhesie durch das Fehlen von Rückbewegung. Bewerben Veterinär Salbe auf die Augen unmittelbar nach der Narkose. Unmittelbar nach der Narkose gelten veterinär Salbe auf die Augen und geben Carprofen (5-10 mg / kg SQ) zur postoperativen Analgesie und Instillation. </li><li> Legen Sie die mouse in Rückenlage auf einer geneigten Plattform. Wie in 2 gezeigt, ein großes Büro Binder mit Nahtschlaufen mit Klebeband am funktioniert sehr gut. </li><li> Rasieren Sie die ventralen Teil des Halses und reinigen und desinfizieren die Hals-Bereich mit 70% Alkohol. Mit neuen Latex- und puderfreie Handschuhe, verwenden chirurgische Instrumente mit 70% Alkohol desinfiziert. </li><li> Mit Hilfe einer scharfen Schere einen kleinen chirurgischen Schnitt in den Hals ca. 12 mm unterhalb der unteren Schneidezähne. </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig die Haut im Nacken kaudal, bis die ventrale Wand der Luftröhre zu sehen. </li><li> Vorsichtig einfahren Zunge und legen Sie die Kanüle mit der gebogene Spitze in Richtung der ventralen Oberfläche der Maus geneigt. Wie in 1.4, ziehen Sie vorsichtig auf die Haut im Nacken, und legen Sie die Kanüle in die Luftröhre. HINWEIS: Mit ein wenig Übung, der Katheter wird sichtbar nach unten bewegen die Luftröhre. Wenn sie in die Speiseröhre geht, dann wird es keine visuelle Beobachtung der Bewegung des Katheters zu sein. Keine Schnittewerden in die Trachea vorgenommen. </li><li> Sobald der Katheter in der Luftröhre im Hals gesehen brachte er etwa 5 mm bis zuverlässig übergeben die Stimmbänder, aber immer noch deutlich über der Carina. </li><li> Bereiten Sie vermitteln bis zu 50 &amp; mgr; l der Flüssigkeit durch die Injektion durch den Katheter mit einem Gel Ladepipettenspitze. Setzen Sie die Spitze in der Luer-Anschluss, aber vor der Injektion genau hinschauen, um die Bewegung der Flüssigkeit in der Spitze synchron mit der Maus die Atmung beobachten. Dann spritzen den instillate. </li><li> Mit einer 1-ml-Spritze, sofort zu tun ein relativ schnelles Aufblasen von 0,6 ml Luft in die Lungen durch den Katheter zu verteilen die Flüssigkeit tief in der Lunge. Entfernen Sie die Kanüle. </li><li> Entfernen Sie die Kanüle. </li><li> Verwenden Sie eine kleine Menge von Cyanacrylat-Klebstoff, um die kleine Operationswunde nach Packungsbeilage Anleitung zum Vetbond schließen. Zeigen Mäuse in Einzelkäfigen und optisch zu überwachen, bis sie aufwachen und normal zu verhalten ohne Angabe von discomfort. </li></ol> 2. Lung Fixation HINWEIS: Wenn alle experimentellen Verfahren werden in einer Maus durchgeführt, können die Lungen zur histologischen Verarbeitung durch Fixierung mit Formaldehyd (oder einem beliebigen anderen Fixiermittel) vorbereitet werden. <ol><li> Opfern Sie die Maus mit einem IACUC akzeptablen Verfahren. Für die Vertreter der Maus im Video gezeigt wird Genickbruch eines betäubten Maus. </li><li> Führen Sie eine Tracheotomie (falls noch nicht geschehen) durch chirurgisches Freilegen der Bauchseite der Luftröhre, indem Sie einen kleinen Schnitt und Einfügen einer 18 G-Stub Nadelspitze in die Luftröhre, und band ihn mit Gewinde. </li><li> Öffnen Sie vorsichtig den Brustkorb mit einem Mittellinienschnitt, schneiden Sie das Zwerchfell, und entfernen Sie die seitlichen Brustwand, um die Lungen aus. </li><li> Verbinden Sie den Luer-Ende der Nadel in ein Reservoir an einem Ringständer Formaldehyd enthält. Siehe Abbildung 3. </li><li> Stellen Sie die Oberseite des Formaldehyds 25 cm über dem Niveau des mouse. Siehe Abbildung 3. Als nächstes stellen Sie sicher, dass sich keine Luft in der Fixierschlauch indem Flüssigkeit aus dem Ende einer Sperrhahn. Verbinden den Luer Ende der Luftröhrenkanüle zum Reservoirschlauch. Öffnen Sie den Wasserhahn, um die Lungen mit dem Formaldehyd aufzublasen. Lassen Sie die Lunge unter Druck für mindestens 20 min. </li><li> Öffnen Sie den Wasserhahn, um die Lungen mit dem Formaldehyd aufzublasen. Lassen Sie die Lunge unter Druck für mindestens 20 min. </li><li> Als nächstes binden Sie die Luftröhre über das Ende der Stichleitung Nadel. Es kann helfen, langsam zurück auf die Nadel ziehen, um mehr von der uncannulated Luftröhre freizulegen. Wenn fest zusammengezogen, entfernen Sie den Wasserhahn. </li><li> Sorgfältig sezieren die Lunge. </li><li> Zeigen die Lunge in Formaldehyd über Nacht. Längere Zeiten sind in Ordnung, und einige Flecken oder Verfahren können bestimmte Zeiten festlegen. Auch andere Flüssigkeiten Fixiermittel wie z-fix kann für die Instillation und Eintauchen verwendet werden. </li><li> Bevor weitere histologische Verarbeitung, zu messendie feste Lungenvolumen als nächstes beschrieben. </li></ol> 3. Messung der Fest Lung Volume <ol><li> Messen Sie das Lungenvolumen mit Archimedes Prinzip wie in 4 dargestellt ist. Entfernen Sie den Fest Lunge aus dem Formaldehyd und sezieren das Herz und andere nicht-Lungengewebe. </li><li> Verwenden Sie einen zuvor konstruierten einfache hausgemachte Drahtstützeinrichtung, die verwendet wird, um die Lungen vollständig unter Wasser zu halten. HINWEIS: Dieses Gerät muss mit je nachdem, was Balance verwendet wird in Einklang gebracht werden. Eine in 5 gezeigte typische Vorrichtung ist aus Plastikpipetten und dünn (20 G) Draht. Dieses System funktioniert gut, wobei der Rest in dem Video verwendet, könnte aber leicht an die meisten Laborwaagen angepaßt werden. </li><li> Stellen Sie ein Becherglas mit ≈200 ml Wasser auf die Waage und tarieren mit dem Tragkäfig anstelle im Wasser. Siehe Abbildung 6 Entfernen Sie den Metallkäfig. legen Sie die Lunge auf der Wasseroberfläche und drücken Sie unter Wassermit dem Käfig. </li><li> Das Gewicht auf die Waage. Diese Zahl entspricht dem Volumen Wasser versetzt und ist somit ein direktes Maß für die Lungenvolumen. Seien Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Lunge oder Nahtmaterial oder einen Teil der Drahtkäfig nicht die Seiten oder Boden des Bechers berühren zu machen. </li><li> Für Richtigkeit, wiederholen Sie diese Messung. Entfernen Sie die Lunge aus dem Wasser, und trocknen auf einem Gewebe. Tarieren das Becherglas mit Käfig in Position und wiederholen Sie den Lungenvolumenmessung. Die beiden Volumenmessungen sollte dann gemittelt werden. HINWEIS: Wenn die Lungen im Formalin für mehr als eine Woche bleibt, wird die Luft in der Lunge in der Flüssigkeit gelöst werden. Wenn dies geschieht, wird der Lungen sinken, so ist es nicht mehr notwendig, irgendeine Vorrichtung wie in Figur 5 zu verwenden, um die Lunge eingetaucht zu lassen. In einem solchen Fall kann die Lautstärke einfach durch Halten der Lunge von einer der Naht Strings, bis es vollständig eingetaucht ist, wie in Figur 4 dargestellt, gemessen werden. </li></ol>

<ol>
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H., Summers-Torres, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Laryngoscopy+in+Mice.">Direct Laryngoscopy in Mice.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 38, 33-35 (1999).</li><li>Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+official+research+policy+statement+of+the+American+Thoracic+Society/European+Respiratory+Society:+standards+for+quantitative+assessment+of+lung+structure.">An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure.</a> Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).</li><li>Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. 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Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+mouse+lung+intubation.">A simple method of mouse lung intubation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).</li><li>MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+simple+method+of+mouse+lung+intubation.">An improved simple method of mouse lung intubation.</a> J Appl Physiol. 106, 984-987 (2009).</li><li>Lum, H., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+10%+formalin+fixation+on+fixed+lung+volume+and+lung+tissue+shrinkage.">Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage.</a> American Reveiw of Respiratory Diseases. 132, 1078-1083 (1985).</li><li>Bishai, J., Fields, M. J., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Mouse+Lung+Volumes+Inflated+with+Air+and+Instilled+Fixatives.">Comparison of Mouse Lung Volumes Inflated with Air and Instilled Fixatives.</a> Proc Am Thorac Soc. 3, A549 (2006).</li><li>Mitzner, W., Brown, R., Lee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+lung+volumes+in+mice.">In vivo measurement of lung volumes in mice.</a> Physiol Genomics. 4, 215-221 (2001).</li></ol>

Die hier beschriebenen Verfahren haben mehrere Vorteile. Zuerst die erforderliche Ausrüstung ist einfach und kostengünstig. Zweitens kann die Intubation schnell mit wenigen Fehlern durchgeführt werden. Drittens erlaubt die Fähigkeit, in die Lunge bei einem konstanten Druck zu fixieren, und dann den Festlungenvolumen korrekte Quantifizierung von Strukturen oder Zellen in der Lunge 10. Ein möglicher Nachteil der Intubation ist die kleine Chirurgie. Dies kann die Möglichkeit, d...

Für eine Reihe von Gründen, Lungenkrebs, nicht sehr stark bei der Maus untersucht. Ein Grund dafür ist, dass der Zugang zu der Lunge in vivo ist sehr schwierig, und die quantitative Analyse von festen Lungen ist nicht allgemein üblich ist. Die in diesem Dokument beschriebenen Methoden wurden entwickelt, um hier Abhilfe zu schaffen. Die Ziele hier sind einfache Methoden, die sich stark in den Aufbau und die Analyse von Mauslungen mit Lungenkrebs oder anderen Pathologien helfen werden zu beschreiben. Während keiner dieser Ansätze völlig neu sind, haben sie nicht gemeinsam als eigenständiges Verfahren in der vereinfachten Weise, wie hier beschrieben dargestellt worden. Es wurden eine Reihe von Handschriften, die Verfahren zur Intubation der Mauslunge in erster Linie für den Zweck dieser Wiederholungslungenfunktion oder bronchoalveoläre Lavage in einzelnen Mäusen in Langzeitstudien beschrieben wurden. Seit diesem ursprünglichen Papier, gab es mehrere andere Papiere, die verschiedenen Ansätze zur mous beschrieben haben,e Intubation 1 -9. Während alle diese Verfahren erfolgreich verwendet werden können, erfordern sie in der Regel erhebliche Ausbildung und sind oft nicht ohne eine nichttriviale Ausfallrate. Darüber hinaus, um die Durchführung Lungenfunktionsmessungen, muss die Kanüle in die Luftröhre fest genug passen, so dass es keine Luftleckage. Allerdings ist eine weitere praktische Verwendung zur Intubation gegenüber spezifischen Agenzien (Krebszellen oder andere Beleidigungen) oder therapeutische Wirkstoffe direkt in die Lunge zu liefern. Ein solches Verfahren erfordert keine eng anliegende Kanüle noch eine anspruchsvolle Lungenfunktionsgeräten. Das neuartige Merkmal dieser hier gezeigten Verfahren eine kleinere chirurgische Prozedur, die die Intubation ermöglicht, ohne die Möglichkeit der Kanüle in die Speiseröhre. Dieser einfache Ansatz ermöglicht erfolgreiche Intubation mit relativ wenig Ausbildung oder Erfahrung. Nicht weniger als 30 Mäusen / h können mit diesem Ansatz mit einer Ausfallrate gegen Null behandelt werden. Sobald ter Mäuse sind bereit, geopfert werden, die verletzt oder Krebs Lunge kann dann zur histologischen und pathologischen Analyse entfernt werden. Um alle histologischen Variablen richtig zu quantifizieren für den Vergleich mit anderen Lunge, ist es jedoch wichtig, die Fixierung Verfahren zu standardisieren und ordnungsgemäß zu quantifizieren, die feste Lungenvolumen 10. Dieses Papier beschreibt im Detail die einfachen Verfahren, standardisierte Befestigungsverfahren sowie eine Möglichkeit, die Festlungenvolumen zu messen, zu ermöglichen. Das Volumen ist ein wesentlicher Metrik bei der Quantifizierung der Histologie, da ohne eine solche Volumenbestimmung kann nur relative Dichten gemessen werden 10. Sobald das Lungenvolumen ist jedoch bekannt, absolute Messungen von Zellen und anderen strukturellen Messungen in der Lunge kann dann quantifiziert werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Laboratory Balance</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>Adventurer Pro Model AV 313&#160;</td>
			<td>Other balances can be used if they have a range of 1 - 300g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 g Luer intravenous catheter</td>
			<td>Insylte</td>
			<td></td>
			<td>Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL laboratory bottle</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Several other possible vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

instillation and fixation methods useful in mouse lung cancer research

Die Möglichkeit, Live-Agenten, Zellen oder Chemikalien direkt in die Lunge zu vermitteln, ohne zu verletzen oder die Tötung der Mäuse ist ein wichtiges Werkzeug bei Lungenkrebs Forschung. Zwar gibt es eine Reihe von Methoden, die veröffentlicht wurden, die zeigen, wie Mäusen Lungenfunktionsmessungen zu intubieren, gibt keine ohne potentielle Probleme für den schnellen Instillation großen Kohorten von Mäusen. In der vorliegenden Arbeit wird eine einfache und schnelle Methode beschrieben, die ein Ermittler ermöglicht die Durchführung einer solchen Instillationen in einer effizienten Weise. Das Verfahren erfordert keine besonderen Werkzeuge oder Beleuchtung erforderlich und kann mit sehr wenig Praxis erlernt werden. Es geht um Anästhesie eine Maus, einen kleinen Schnitt in den Hals, um die Luftröhre sichtbar zu machen, und dann direkt Einfügen einer intravenösen Katheter. Der kleine Einschnitt rasch mit Gewebekleber verschlossen und die Mäuse werden sich erholen gelassen. Ein erfahrener Student oder Techniker kann Instillationen mit einer durchschnittlichen Rate von 2 min / Maus zu tun. Sobald ter Krebs festgestellt, gibt es oft eine Notwendigkeit für quantitative histologische Analyse der Lungen. Pathologen traditionell in der Regel nicht die Mühe, Lunge Inflation während der Fixierung zu standardisieren und Analysen sind oft auf einem Punktesystem, das sehr subjektiv sein kann, basiert. Während dies einmal für grobe Schätzung der Größe eines Lungentumors ausreichend ausreichend sein, jedes richtige stereo Quantifizierung von Lungenstruktur oder Zellen erfordert eine reproduzierbare Fixierung und der nachfolgenden Lungenvolumenmessung. Hier beschreiben wir einfache zuverlässige Verfahren sowohl für die Festsetzung der Lunge unter Druck und dann die genaue Messung der Festlungenvolumen. Die einzige Voraussetzung ist eine Laborwaage, die genau über einen Bereich von 1 mg-300 g ist. Die hier so vorgestellt Verfahren könnten die Fähigkeit, in den Mäusen zu erstellen, zu behandeln und zu analysieren Lungenkrebs deutlich verbessern.

Das Verfahren beschreibt in dem ersten Protokoll nicht von selbst zu irgendeinem generali Ergebnissen führen. Es beschreibt nur ein sehr zuverlässiges Mittel zur Substanzen direkt in die Luftröhre zu vermitteln. Figur 7 zeigt ein Beispiel einer Lunge, in dem Trypanblau wurde mit dem hier beschriebenen Verfahren eingeimpft. Gibt es weit verbreitete Verteilung des Farbstoffs, ähnlich wie es mit anderen Farbstoffen oder Tracer direkt in die Trachea oder Mäusen 11,12 gegeben...

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Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

Das Ziel dieser Arbeit ist es, einfache Methoden, die sich stark in den Aufbau und die Analyse von Mauslungen mit Lungenkrebs oder anderen Pathologien helfen werden zu beschreiben. Wir stellen 3-Protokolle, um einfach und zuverlässig durchführen Lungen Instillationen, Fixierung, und Lungenvolumenmessungen.

Instillation und Fixationsmethoden Nützlich in Maus Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

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28.1K Aufrufe.  Johns Hopkins University.  Das Ziel dieser Arbeit ist es, einfache Methoden, die sich stark in den Aufbau und die Analyse von Mauslungen mit Lungenkrebs oder anderen Pathologien helfen werden zu beschreiben. Wir stellen 3-Protokolle, um einfach und zuverlässig durchführen Lungen Instillationen, Fixierung, und Lungenvolumenmessungen. 

Serie: Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Forschung

Medizin

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Eine einfache Methode der Maus Lung Intubation

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

Nichtinvasive Intratracheale Intubation, die Pathologie und Physiologie der Maus Lung Study

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Diagnostic Ultrasound Imaging of Mouse Diaphragm Function

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive surgical procedures. Although this is an effective method of assessing in vitro diaphragm activity, it involves non-survival surgery. The application of non-invasive ultrasound imaging as an in vivo procedure is beneficial since it not only reduces the number of animals sacrificed, but is also suitable for monitoring disease progression in live mice. Thus, our ultrasound imaging method may likely assist in the development of novel therapies that alleviate muscle injury induced by various respiratory diseases. Particularly, in clinical diagnoses of obstructive lung diseases, ultrasound imaging has the potential to be used in conjunction with other standard tests to detect the early onset of diaphragm muscle fatigue. In the current protocol, we describe how to accurately evaluate diaphragm contractility in a mouse model using a diagnostic ultrasound imaging technique.

Diagnostic ultrasound imaging has proven to be effective in diagnosing various respiratory diseases in human and animal subjects. We demonstrate a comprehensive ultrasound protocol utilized by Dr. Zuo's lab to analyze diaphragm kinetics specifically in mouse models. This is also a non-invasive research technique which can provide quantitative information on mouse respiratory muscle function.

Diagnostische Ultraschall-Bildgebung der Maus Membranfunktion

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive ...

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as models of pulmonary disease often resemble the situation of the human lung much better than mice do. Working with large animals also offers the opportunity to sample the same animal repeatedly over a certain course of time, which allows long-term studies without sacrificing the animals.
The aim was to establish in vivo sampling methods for the use in a bovine model of a respiratory Chlamydia psittaci infection. Sampling should be performed at various time points in each animal during the study, and the samples should be suitable to study the host response, as well as the pathogen under experimental conditions.
Bronchoscopy is a valuable diagnostic tool in human and veterinary medicine. It is a safe and minimally invasive procedure. This article describes the intrabronchial inoculation of calves as well as sampling methods for the lower respiratory tract. Videoendoscopic, intrabronchial inoculation leads to very consistent clinical and pathological findings in all inoculated animals and is, therefore, well-suited for use in models of infectious lung disease. The sampling methods described are bronchoalveolar lavage, bronchial brushing and transbronchial lung biopsy. All of these are valuable diagnostic tools in human medicine and could be adapted for experimental purposes to calves aged 6-8 weeks. The samples obtained were suitable for both pathogen detection and characterization of the severity of lung inflammation in the host.

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

This article describes bronchoscopic techniques in the bovine lung under experimental conditions, i.e. bronchoscopically guided inoculation, bronchoalveolar lavage, bronchial brushing, and transbronchial lung biopsy.

Die Bovine Lung in der biomedizinischen Forschung: Optisch Geführte Bronchoskopie, intrabronchial Inokulation und<em&gt; In Vivo</em&gt; Sampling-Techniken

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

Intubation vermittelte Intratracheale (IMIT) Instillation: eine nichtinvasive, lungenspezifischen Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Echocardiographic Measurement of Right Ventricular Diastolic Parameters in Mouse

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV diastolic function is rarely quantified in experimental studies. This might be due to technical difficulties in the visualization of the RV in the apical four-chamber view in rodents. Here we describe two positions facilitating the visualization of the apical four-chamber view in mice to assess the RV diastolic function.
The apical four-chamber view is enabled by tilting the mouse fixation platform to the left and caudally (LeCa) or to the right and cranially (RiCr). Both positions provide images of comparable quality. The results of the RV diastolic function obtained from two positions are not significantly different. Both positions are comparably easy to perform. This protocol can be incorporated into published protocols and enables detailed investigations of the RV function.

Here we describe and compare two positions for obtaining the apical four-chamber view in mice. These positions enable the quantification of the right ventricular function, provide comparable results, and can be used interchangeably.

Echokardiographische Messung rechtsventrikulärer diastolischer Parameter in der Maus

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV ...

Lung Fixation under Constant Pressure for Evaluation of Emphysema in Mice

Emphysema is a significant feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Studies involving an emphysematous mouse model require optimal lung fixation to produce reliable histological specimens of the lung. Due to the nature of the lung&rsquo;s structural composition, which consists largely of air and tissue, there is a risk that it collapses or deflates during the fixation process. Various lung fixation methods exist, each of which has its own advantages and disadvantages. The lung fixation method presented here utilizes constant pressure to enable optimal tissue evaluation for studies using an emphysematous mouse lung model. The main advantage is that it can fix many lungs with the same condition at one time. Lung specimens are obtained from chronic cigarette smoke-exposed mice. Lung fixation is performed using specialized equipment that enables the production of constant pressure. This constant pressure maintains the lung in a reasonably inflated state. Thus, this method generates a histological specimen of the lung that is suitable to evaluate cigarette smoke-induced mild emphysema.

Presented here is a useful protocol for lung fixation that creates a stable condition for histological evaluate of lung specimens from a mouse model of emphysema. The main advantage of this model is that it can fix many lungs with the same constant pressure without lung collapse or deflation.

Lungenfixierung unter konstantem Druck zur Beurteilung von Emphysem bei Mäusen

Emphysema is a significant feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Studies involving an emphysematous mouse model require optimal lung ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

Induzieren akute Lungenschädigung bei Mäusen durch direkte intratracheale Lipopolysaccharid-Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...