Name: a standardized method for measuring internal lung surface area via mouse pneumonectomy and prosthesis implantation
Uploaded: 2017-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Method for Measuring Internal Lung Surface Area via Mouse Pneumonectomy and Prosthesis Implantation at JoVE.com

Die Autoren möchten das National Institute of Biological Sciences, Peking für die Unterstützung anerkennen. Diese Arbeit wurde von Beijing Municipal Natural Science Foundation (Nr. Z17110200040000) unterstützt.

Alle in diesem Protokoll verwendeten Verfahren wurden gemäß den Empfehlungen in den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Nationalen Instituts für Biowissenschaften, Peking, durchgeführt. 8 Wochen alte CD-1 männliche Mäuse wurden in einer bestimmten pathogenfreien (SPF) -Funktion untergebracht, bis die Experimente durchgeführt wurden. Operationen wurden unter Verwendung von vollständig anästhesierten Mäusen durchgeführt ( dh ohne Zehen-Quetschantworten). Nach der Operation wurden die Mäuse in einem warmen, feuchten Raum mit ausreichend Nahrung und Süßwasser gehalten. Die Mäuse wurden unter Verwendung einer Überdosierung der Anästhesie, die durch intraperitoneale Injektion geliefert wurde, geopfert. 1. Maus PNX Chirurgie <ol><li> Vollständige Betäubung der Mäuse mit Natrium-Phenobarbital (120 mg / kg Körpergewicht) und Buprenorphin (0,1 mg / kg Körpergewicht) über intraperitoneale (IP) Injektion. Chirurgie durchführen, wenn Mäuse nicht mehr auf Zehenkneifen reagieren. </li><li> Haare auf dem linken Thorax der Mäuse mit Chemikalien dep entfernenIlatale Behandlung (~ 3 x 3 cm 2 Fläche). </li><li> Sichern Sie jede Maus auf einer Intubationsplattform mit ihrer ventralen Seite, die dem Bediener zugewandt ist ( Abbildung 1A ). </li><li> Ziehen Sie die Zunge heraus und beleuchten Sie die Stimmbänder mit einem kleinen Tierlaryngoskop, das eine Kerbe zur Führung der Katheter 18 enthält ( Abbildung 1A ). </li><li> Unterscheiden Sie die Stimmbänder, indem Sie die Bewegungen der Stimmbänder beim Atmen beobachten. Legen Sie vorsichtig eine 20 G intravenöse Intubationskanüle in die Trachea an einem vorderen Winkel 19 ein . </li><li> Legen Sie Mäuse in eine rechte seitliche Liegeposition und verbinden Sie die Kanüle mit einem mechanischen Beatmungsgerät ( z. B. druckgesteuert, siehe Tabelle der Materialien ). Überprüfen Sie das Einsetzen der Kanüle in die Trachea, indem Sie die Atembewegungen der Mauskiste beobachten ( Abbildung 1B ). </li><li> Setzen Sie den Inspirationsdruck oF das Ventilator auf 12 cm H 2 O stellen und die Atemfrequenz auf 120 Atemzüge pro Minute einstellen ( Abbildung 1B ). </li><li> Dekontaminieren Sie die Haut im chirurgischen Bereich mit Betadin und 70% Ethanol. </li><li> Führe ein 2 - 3 cm posterolateralen Thorakotomie Inzision in dem Raum am 5. Interkostalraum, geschnitten durch die Haut und Muskeln mit Noyes Feder Schere (Schneidkante: 14 mm; Spitzendurchmesser: 0,275 mm) (2B, C). Chirurgische Instrumente, die für das Thorakotomieverfahren verwendet werden, werden vor der Verwendung sterilisiert. </li><li> Machen Sie einen 1,5 cm langen Schnitt im 5. Intercostalraum die linke Lunge (2D, E) zu belichten. Während des Betriebes einen Hochtemperatur-Kauterisierer verwenden, um das Ausbluten zu stoppen. </li><li> Heben Sie ein Drittel des linken Lungenlappens aus der Brust mit stumpfen Spitzenzangen ( Abbildung 2F ) und verwenden Sie dann einen Wattestäbchen, um die gesamte linke herauszuziehenLunge ( Abbildung 2G ). </li><li> Identifizieren Sie die Pulmonalarterie und Bronchien des linken Lungenlappens ( Abbildung 2G ). </li><li> Ziehen Sie die Bronchien und Gefäße am Hilum mit einer Seidenchirurgie an und ziehen Sie den linken Lungenlappen bei 3 - 4 mm von der Ligation aus ( Abbildung 2H , I ). HINWEIS: Achten Sie darauf, dass Sie die Nahtknoten am linken Hilum nicht abschneiden, was Pneumothorax ( dh Luft oder Gas in der Kavität des Thorax) verursachen kann . </li><li> Schließen Sie die Brustwand mit 1 Naht, und dann sticken Sie die Muskelschicht und die Hautschicht nacheinander, mit 5 - 6 unterbrochenen Nähten. Lassen Sie einen Abstand von 3 - 4 mm zwischen jeder Naht ( Abbildung 2M , 2N ). HINWEIS: Halten Sie die chirurgische Nahtnadel vom Herzen weg; Unbeabsichtigte Herzpunktion führt zum sofortigen Tod. </li><li> Desinfizieren Sie den chirurgischen Bereich mit Povidon-Iod. </li><li> AfteR die chirurgische Operation, platziere die Maus auf eine 38 ° C thermische Pad und verbinden die Maus mit dem Ventilator, bis spontane Atembewegungen beginnen ( Abbildung 2O ). </li></ol> 2. Prothesenimplantation <ol><li> Führen Sie die Schritte 1.1 - 1.13 des PNX-Verfahrens durch (dh bis zu dem Punkt, an dem der linke Lungenlappen der Maus entfernt wird). </li><li> Klemmen Sie die Mitte der Silikonprothese (kundenspezifisch, 12 mm in der Länge, 3 mm in der Dicke, 7 mm in der Breite, 0,2 g, Ellipsoid-Form) mit stumpfen Zangen ( Abbildung 2J ). Sterilisieren Sie die Silikonprothese vor dem Einsetzen. </li><li> Halten Sie die Rippe mit einer Pinzette mit einer Hand, um die Thoraxhöhle freizulegen, und legen Sie dann die Prothese in die linke leere Thoraxhöhle mit einer anderen Hand ein. HINWEIS: Der Einführungswinkel beträgt etwa 45 Grad zwischen der Frontalebene der Prothese und der Thoraxoberfläche ( Abbildung 2K ,L). Sei sehr schonend beim Einsetzen der Prothese. Übermäßige Kraft führt zu Pleuraruptur. </li><li> Passen Sie die Ausrichtung der Prothese mit stumpfen Pinzetten an, um sicherzustellen, dass die Prothese die linke leere Thoraxhöhle einnimmt. </li><li> Führen Sie Schritte 1.14 - 1.16 der Maus PNX-Prozedur. </li></ol> 3. Messung von ILV <ol><li> Vorbereiten eines kundenspezifischen Gerätes (&quot;Inflationsröhrchen&quot;), das aus einem aus einer Einweg-Seropipette (10 ml) entfernten Stößel besteht, einem 40 cm langen Schlauch mit Nadeladapter, einem Durchflussregelventil und einer 18 G-Nadel. Nach der Montage die Pipette auf einem Brett mit Klebeband befestigen ( Abbildung 3A ). Der Abstand zwischen der Oberseite der Pipette und der Versuchsbank muss mindestens 30 cm betragen. </li><li> Bereiten Sie frische 4% Paraformaldehyd (PFA) Fixierlösung vor, indem Sie 20 g PFA in 500 ml vorgewärmter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einem 55 ° C Wasserbad auflösen und manuell schüttelnCe alle 10 min, bis die Lösung klar ist. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur filtriere die Lösung mit einem 0,45 μm Filter. ACHTUNG: Bei der Handhabung von PFA geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen. </li><li> Opfer Mäuse mit einer Überdosis Injektion von Anästhetikum (0,8% Phenobarbital Natrium, 1.000 U / ml Heparin). </li><li> Sichern Sie jede Maus auf eine Polystyrol-Dissektion Platte und sprühen Sie sie mit 70% Alkohol. </li><li> Vorsichtig öffnen Sie die Maus Brust und schneiden Sie das Brustbein mit Schere, um die Lungenlappen gründlich auszusetzen. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Gewebe mit einer Schere, um die Trachea freizulegen. Achten Sie darauf, die Trachea aus der Speiseröhre zu trennen. </li><li> Schneide die Bauch-Aorta und stecke eine 25-Gauge-Nadel in den rechten Herzschritt des Herzens ein. Verbinden Sie die Nadel mit einer 20 mL Spritze vor dieser Insertion. Langsam schieben Sie 1x PBS in das Herz, um Blutzellen zu entfernen, bis Lungen weiß werden. Typischerweise sind 5 - 10 ml PBS erforderlich, um die pulmonalen Blutgefäße zu löschen. </li><li> Füllen thE maßgeschneiderte Inflationsröhre mit 4% frischem PFA und entfernen Sie alle Blasen aus dem Aufblasrohr. </li><li> Setzen Sie die 18-Gauge-Nadel des Aufblasrohres in die Trachea ein und klemmen Sie die Trachea mit Gefäßklammern, um Flüssigkeitsverluste zu vermeiden. </li><li> Lungen mit 4% PFA bei konstantem Transpulmonaldruck von 25 cm / H 2 O 2 , 20 auflösen. Inkubieren Sie die Lungen bei Raumtemperatur für 2 h, um vollständig ausgedehnte Lungen zu erreichen. Dieser &quot;Pre-fix&quot; -Schritt ist entscheidend für die Erhaltung der Lungenmorphologie. <ol><li> Durch die Überwachung des Aufblasrohres den Wert des ursprünglichen 4% PFA-Volumens aufzeichnen und das Endvolumen aufzeichnen. Das interne Lungenvolumen entspricht dem ursprünglichen 4% PFA-Volumen abzüglich des endgültigen 4% PFA-Volumens. </li></ol></li><li> Ligate die Trachea und mit Schere, sanft sezieren die Lungen (halten die Lunge intakt) aus umliegenden Bindegewebe. Sei sehr sanft, um die Lunge nicht zu beschädigen. </li><li> IncuDie Lungen in einem 50-ml-konischen Röhrchen, gefüllt mit 4% PFA, für 12 h bei 4 ° C unter leichtem Schütteln auf einem Shaker (50 U / min). Gehen Sie zur Gewebeverarbeitung und -färbung vor (siehe Abschnitt 4). </li></ol> 4. Gewebeeinbettung, Sektionierung und Hämatoxylin &amp; Eosin (H &amp; E) Färbung <ol><li> Nach der Fixierung, verwenden Sie Noyes Spring Scissors, um das Herz und übermäßige Bindegewebe aus der Lunge zu trimmen. Die einzelnen Lungenlappen vorsichtig trennen, indem man den Bronchus abschneidet, der die Lungenlappen mit der Trachea verbindet. </li><li> Die Lungenlappen 3 - 4 mal in 50 mL 1x PBS (30 min / waschen) auf einem Orbitalschüttler (50 U / min) abwaschen. </li><li> Nach der abschließenden Wäsche kryoprotect die Lungenlappen durch Eintauchen in eine 30% ige Saccharose-Lösung (in 1x PBS) bei 4 ° C, bis das Gewebe auf den Boden der 50-mL-Kegelrohre sinkt (ca. 12 h). </li><li> Vor dem Einbetten und Kochen der Gewebe, entfernen Sie die Lungenkeulen Proben aus den Rohren mit Pinzette, behalten Sie den ZugangFür die histologische Analyse, die verbleibende Saccharose-Lösung von der Oberfläche der Zubehör-Lappenproben abtupfen und dann die Probe in eine Petrischale, die eine optimale Schneidetemperatur (OCT) -Verbindung enthält, für etwa 30 min eintauchen. </li><li> Gefrieren Sie die OCT-eingebetteten Zubehörlappenproben in flüssigem Stickstoff mit Kryomaten. Positionieren Sie die größte Fläche des Lappens parallel zum Boden der Form. </li><li> Vorbereitung von insgesamt drei 10 μm dicken Abschnitten für jede Probe während der Kryoschaltung für die histologische Analyse. Verwerfen Sie das erste 1 mm Gewebe, sammeln Sie einen 10 μm dicken Abschnitt, entsorgen Sie 0,5 mm Gewebe, sammeln Sie einen anderen Abschnitt, verwerfen Sie 0,5 mm Gewebe und sammeln Sie den dritten (endgültigen) Abschnitt. </li><li> Luft trocknen die Abschnitte für 1 Stunde vor der Durchführung von H &amp; E-Färbung. </li><li> H &amp; E-Färbung durchführen <ol><li> Waschen Sie die Abschnitte in 3 - 4 Änderungen des Leitungswassers und färben Sie dann die Abschnitte in frischem Hämatoxylin für 2 min; Spülen Sie den Abschnitt unter laufendem Leitungswasser aus; Tauchen Sie den Abschnitt zweimal in eine 1% ige HCl-70% ige Ethanollösung ein, um überschüssiges Hämatoxylin zu entfernen. </li><li> Färben Sie den Abschnitt in frischem Eosin für 3 min; Dehydrieren die Abschnitte mit zwei aufeinanderfolgenden 30 s-Waschungen in 95% Ethanol und zwei 30-s-Waschungen mit 100% Ethanol; Die Abschnitte in Xylol für 30 s klar, wiederholen Sie den Clearing-Schritt einmal in frischem Xylol; Montieren Sie die Objektträger mit Montagemedium mit Glasdeckel. </li></ol></li></ol> 5. Quantifizierung von MLI <ol><li> Erfassen Sie digitale Bilder der H &amp; E-gefärbten Zubehörlappenabschnitte (20fache Vergrößerung) mit einem hellen Feldmikroskop. </li><li> Um das MLI zu quantifizieren, wählen Sie aus den passenden Bereichen (ohne Arterien und Venen, Hauptluftwege und Alveolarkanäle) aus insgesamt 15 nicht überlappenden Sichten (1.000 μm x 1.000 μm) zufällig. </li><li> Legen Sie ein Gitter mit 10 gleichmäßig verteilten senkrechten Linien und 10 gleich verteilten horizontalen Linien von definierten lenGth (1.000 μm) auf den gewählten Sichtfeldern mit einem Linealwerkzeug; Jede Linie ist somit um 100 μm voneinander beabstandet ( Fig. 4B ). </li><li> Definieren Sie den Wert eines Intercept als lineare Länge zwischen zwei benachbarten Alveolarepithelien. Messen Sie die Werte aller Abschnitte entlang jeder Länge von 1.000 μm. </li><li> Für jedes Gitter quantifizieren Sie die Werte aller Abschnitte zwischen den 10 horizontalen 1.000 μm Längenlinien und den 10 vertikalen 1.000 μm Längenlinien. ANMERKUNG: MLI ist der Mittelwert der Abschnittslängen von insgesamt 15 Gittern, die aus den 3 Abschnitten analysiert wurden, die für jeden der zusätzlichen Lappen vorbereitet wurden. </li></ol> 6. Berechnung der ISA <ol><li> Berechnen Sie die ISA mit Gleichung 1 (siehe Einleitung ). Siehe Abschnitt 3 für die Messung von ILV und siehe Abschnitt 5 zur Quantifizierung von MLI. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In diesem Protokoll liefern wir detaillierte Beschreibungen über die Messung der pulmonalen Parameter nach der Maus links Lunge PNX und Prothese Implantation. ISA gilt heute als Schlüsselmetrik für die Beurteilung der Atemfunktion bei vielen Lungenerkrankungen und bei der Verletzungsinduzierten alveolären Regeneration. Obwohl die Lungenforschungsgemeinschaft sich über die Nützlichkeit von ISA als nützliche Metrik einverstanden ist, gab es bislang nur wenig die Standardisierung der Messung von ILV und MLI, die bei...

Die Grundfunktion der Lunge ist der Austausch von Sauerstoff und Kohlendioxid zwischen Blutgefäßen und der Atmosphäre. Lungenerkrankungen wie bronchopulmonale Dysplasie (BPD), chronisch obstruktive Lungenkrankheit (COPD) und akute Atemwegsinfektionen führen zu einer verminderten ISA 2 . Forscher, die Lungenkrankheit studieren, haben mehrere quantitative Methoden entwickelt, um morphologische Veränderungen in den Lungen, einschließlich MLI, ILV, Anzahl der Gasaustauscheinheiten, ISA und Lungengewebe Compliance 2 , 3 zu bewerten. Pionierstudien von Weibel et al. 4 und Duguid et al. 5 zusammen festgestellt, dass ISA als direkte Maßnahme der Lungengasaustauschkapazität in menschlichen Lungen verwendet werden kann und als Kriterium für die Bestimmung des Emphysemschweregrads verwendet werden kann. Eine Reihe von Studien, die in den letzten fünf Jahren veröffentlicht wurden, verwendeten Lungen-morphologische Parameter ( z. </eM&gt; ISA und MLI) zur Beurteilung morphologischer und funktioneller Veränderungen in der Lunge von Mäusen während der Entwicklung 6 und während der Erholung von Verletzungen PNX 1 , 7 . ISA wird nach Gleichung 1 8 , 9 berechnet: <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/56114/56114eq1.jpg" /> , Wobei ILV das interne Lungenvolumen ist und MLI ein Zwischenparameter ist, der die pulmonale periphere Luftraumgröße 10 darstellt . PNX, die chirurgische Entfernung von einem oder mehreren Lungenlappen, wurde weithin berichtet, um eine alveoläre Regeneration bei vielen Spezies, einschließlich der Menschen 11 , Mäuse 1 , Hunde 12 , Ratten 13 und Kaninchen 14 , 15 zu induzieren. Ein BolzenY von Mäusen Lungen an vierzehn Tagen nach PNX zeigte, dass sowohl die Erweiterung der bereits bestehenden Alveolen und die de novo Bildung von Alveolen zur Wiederherstellung von ISA, ILV und die Anzahl der Alveolen in den verbleibenden Lungengewebe 1 beitragen. Wir und andere haben gezeigt, dass die Einfügung von Materialien wie Schwamm, Wachs oder einer kundenspezifischen Prothese in die leere Thoraxhöhle nach PNX ( dh Prothesenimplantation) die Alveolenregeneration beeinträchtigt. Es ist nun fest etabliert, dass die mechanische Kraft als einer der wichtigsten Faktoren für die Initiierung der Alveolenregeneration 1 , 16 , 17 fungiert . Solche Studien haben die Wirksamkeit der Verwendung von ISA-Werten aus PNX-behandelten und Prothesen-implantierten Lungen als Kriterium zur quantitativen Bewertung der Alveolenregeneration hervorgehoben. Observer Bias ist bekannt, um signifikante Einfluss gemessen vaFür lungenmorphologische Parameter ( zB MIL und ILV). Standardisierte Protokolle können verwendet werden, um diese Vorspannung bei der Bestimmung sowohl ILV und MLI, die die beiden Parameter bei der Berechnung von ISA verwendet werden, zu vermeiden. Hier stellen wir hoch detaillierte, standardisierte Protokolle zur Messung dieser Lungenparameter zur Verfügung. Wichtig ist, dass die Fähigkeit, ISA genau zu quantifizieren, die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit von Studien der Lungenfunktion in verletzungsinduzierten alveolären Regenerationsmodellen zu verbessern und mechanistische Entdeckungen bei multiplen Lungenerkrankungen zu erleichtern.

<table><tbody><tr><td>Low cost cautery kit</td><td>Fine Science Tools</td><td>18010-00</td><td></td></tr><tr><td>Noyes scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>Standard pattern forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Micro Needle Holders</td><td>Fine Science Tools</td><td>12060-01</td><td></td></tr><tr><td>Vessel clips</td><td>Fine Science Tools</td><td>18374-44</td><td></td></tr><tr><td>I. V. Cannula-20 gauge</td><td>Jinhuan Medical Product Co., LTD.</td><td>29P0601</td><td></td></tr><tr><td>Surgical suture</td><td>Jinhuan Medical Product Co., LTD.</td><td>F602</td><td></td></tr><tr><td>Mouse intubation platform</td><td>Penn-Century, Inc</td><td>Model MIP</td><td></td></tr><tr><td>Small Animal Laryngoscope</td><td>Penn-Century, Inc</td><td>Model LS-2-M</td><td></td></tr><tr><td>TOPO Small Animal Ventilator</td><td>Kent Scientific</td><td>RSP1006-05L</td><td></td></tr><tr><td>Thermal pad</td><td>Stuart equipment</td><td>SBH130D</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodium salt</td><td>Sigma</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin Solution</td><td>Sigma</td><td>GHS132</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y solution, alcoholic</td><td>Sigma</td><td>HT110116</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipette</td><td>Thermo Scientific</td><td>170356</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>cryosection machine</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Base Molds</td><td>Fisher HealthCare</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>Povidone iodine</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027132</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP82011</td><td></td></tr><tr><td>Infusion sets for single use</td><td>Weigao</td><td>SFDA 2012 3661704</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Tapes</td><td>3M Scotch</td><td>8915</td><td></td></tr><tr><td>Cotton pad</td><td>Vinda</td><td>Dr.P</td><td></td></tr><tr><td>Silicone prosthesis</td><td>Custom made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brightfield microscope</td><td>Olympus</td><td>VS120</td><td></td></tr><tr><td>Ruler tool</td><td>Adobe Photoshop</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a standardized method for measuring internal lung surface area via mouse pneumonectomy and prosthesis implantation

Pulmonary morphology, physiology, and respiratory functions change in both physiological and pathological conditions. Internal lung surface area (ISA), representing the gas-exchange capacity of the lung, is a critical criterion to assess respiratory function. However, observer bias can significantly influence measured values for lung morphological parameters. The protocol that we describe here minimizes variations during measurements of two morphological parameters used for ISA calculation: internal lung volume (ILV) and mean linear intercept (MLI). Using ISA as a morphometric and functional parameter to determine the outcome of alveolar regeneration in both pneumonectomy (PNX) and prosthesis implantation mouse models, we found that the increased ISA following PNX treatment was significantly blocked by implantation of a prosthesis into the thoracic cavity1. The ability to accurately quantify ISA is not only expected to improve the reliability and reproducibility of lung function studies in injured-induced alveolar regeneration models, but also to promote mechanistic discoveries of multiple pulmonary diseases.

<html> Wir haben hier ein Experiment mit einer PNX-behandelten Gruppe und einer Prothesenimplantation (Prothesen-implantierte) Gruppe durchgeführt. Diese Gruppierungen sind die gleichen wie die Gruppierungen, die in einer zuvor veröffentlichten Studie aus unserer Arbeitsgruppe verwendet wurden 14 . Die Maus-PNX- und Prothesenimplantationsverfahren sind in Abbildung 2 dargestellt</s...

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A Standardized Method for Measuring Internal Lung Surface Area via Mouse Pneumonectomy and Prosthesis Implantation

Die interne Lungenoberfläche (ISA) ist ein kritisches Kriterium für die Beurteilung der Lungenmorphologie und der Physiologie bei Lungenkrankheiten und der verletzungsinduzierten alveolären Regeneration. Wir beschreiben hier eine standardisierte Methode, die die Messvorspannung für ISA sowohl in der Lungenpneumonektomie als auch in den Prothesenimplantationsmausmodellen minimieren kann.

Eine standardisierte Methode zur Messung der inneren Lungenoberfläche über Maus Pneumonektomie und Prothesenimplantation

Pulmonary morphology, physiology, and respiratory functions change in both physiological and pathological conditions. Internal lung surface area (ISA), ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.1K Aufrufe.  Peking University.  Die interne Lungenoberfläche (ISA) ist ein kritisches Kriterium für die Beurteilung der Lungenmorphologie und der Physiologie bei Lungenkrankheiten und der verletzungsinduzierten alveolären Regeneration. Wir beschreiben hier eine standardisierte Methode, die die Messvorspannung für ISA sowohl in der Lungenpneumonektomie als auch in den Prothesenimplantationsmausmodellen minimieren kann. 

Serie: A Standardized Method for Measuring Internal Lung Surface Area via Mouse Pneumonectomy and Prosthesis Implantation

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Eine einfache Methode der Maus Lung Intubation

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Forschung

Medizin

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly hydrated, forming a substantial endothelial surface layer (ESL) that contributes to the maintenance of endothelial function. As the endothelial glycocalyx is often aberrant in vitro and is lost during standard tissue fixation techniques, study of the ESL requires use of intravital microscopy. To best approximate the complex physiology of the alveolar microvasculature, pulmonary intravital imaging is ideally performed on a freely-moving lung. These preparations, however, typically suffer from extensive motion artifact. We demonstrate how closed-chest intravital microscopy of a freely-moving mouse lung can be used to measure glycocalyx integrity via ESL exclusion of fluorescently-labeled high molecular weight dextrans from the endothelial surface. This non-recovery surgical technique, which requires simultaneous brightfield and fluorescent imaging of the mouse lung, allows for longitudinal observation of the subpleural microvasculature without evidence of inducing confounding lung injury.

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx/endothelial surface layer is ideally studied using intravital microscopy. Intravital microscopy is technically challenging in a moving organ such as the lung. We demonstrate how simultaneous brightfield and fluorescent microscopy may be used to estimate endothelial surface layer thickness in a freely-moving in vivo mouse lung.

In vivo Messung der Maus Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as the bone, brain, and lung. Although extensively studied, the mechanistic details of this process remain poorly understood. While common imaging modalities, including computed tomography (CT), positron emission tomography (PET), and magnetic resonance imaging (MRI), offer varying degrees of gross visualization, each lacks the temporal and spatial resolution necessary to detect the dynamics of individual tumor cells. To address this, numerous techniques have been described for intravital imaging of common metastatic sites. Of these sites, the lung has proven especially challenging to access for intravital imaging owing to its delicacy and critical role in sustaining life. Although several approaches have previously been described for single-cell intravital imaging of the intact lung, all involve highly invasive and terminal procedures, limiting the maximum possible imaging duration to 6-12 h. Described here is an improved technique for the permanent implantation of a minimally invasive thoracic optical Window for High-Resolution Imaging of the Lung (WHRIL). Combined with an adapted approach to microcartography, the innovative optical window facilitates serial intravital imaging of the intact lung at single-cell resolution across multiple imaging sessions and spanning multiple weeks. Given the unprecedented duration of time over which imaging data can be gathered, the WHRIL can facilitate the accelerated discovery of the dynamic mechanisms underlying metastatic progression and numerous additional biologic processes within the lung.

Here, we present a protocol for the surgical implantation of a permanently indwelling optical window for the murine thorax, which enables high-resolution, intravital imaging of the lung. The permanence of the window makes it well-suited to the study of dynamic cellular processes in the lung, especially those that are slowly evolving, such as metastatic progression of disseminated tumor cells.

Ein permanentes Fenster zur Untersuchung von Krebsmetastasen in der Lunge

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

Krebsforschung

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill&#8217;s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson&#8217;s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

Automatisierte Messung von Lungenemphysem und Klein Airway Remodeling im Zigarettenrauch ausgesetzten Mäuse

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Mouse Pneumonectomy Model of Compensatory Lung Growth

In humans, disrupted repair and remodeling of injured lung contributes to a host of acute and chronic lung disorders which may ultimately lead to disability or death. Injury-based animal models of lung repair and regeneration are limited by injury-specific responses making it difficult to differentiate changes related to the injury response and injury resolution from changes related to lung repair and lung regeneration. However, use of animal models to identify these repair and regeneration signaling pathways is critical to the development of new therapies aimed at improving pulmonary function following lung injury. The mouse pneumonectomy model utilizes compensatory lung growth to isolate those repair and regeneration signals in order to more clearly define mechanisms of alveolar re-septation. Here, we describe our technique for performing mouse pneumonectomy and sham pneumonectomy. This technique may be utilized in conjunction with lineage tracing or other transgenic mouse models to define molecular and cellular mechanism of lung repair and regeneration.

Mouse pneumonectomy is a commonly employed model of compensatory lung growth. This procedure can be used in conjunction with lineage tracing or transgenic mouse models to elucidate underlying mechanisms.

Maus Pneumonektomie Modell der Ausgleichs Lung Wachstum

In humans, disrupted repair and remodeling of injured lung contributes to a host of acute and chronic lung disorders which may ultimately lead to ...

Measurement of the Pressure-volume Curve in Mouse Lungs

In recent decades the mouse has become the primary animal model of a variety of lung diseases. In models of emphysema or fibrosis, the essential phenotypic changes are best assessed by measurement of the changes in lung elasticity. To best understand specific mechanisms underlying such pathologies in mice, it is essential to make functional measurements that can reflect the developing pathology. Although there are many ways to measure elasticity, the classical method is that of the total lung pressure-volume (PV) curve done over the whole range of lung volumes. This measurement has been made on adult lungs from nearly all mammalian species dating back almost 100 years, and such PV curves also played a major role in the discovery and understanding of the function of pulmonary surfactant in fetal lung development. Unfortunately, such total PV curves have not been widely reported in the mouse, despite the fact that they can provide useful information on the macroscopic effects of structural changes in the lung. Although partial PV curves measuring just the changes in lung volume are sometimes reported, without a measure of absolute volume, the nonlinear nature of the total PV curve makes these partial ones very difficult to interpret. In the present study, we describe a standardized way to measure the total PV curve. We have then tested the ability of these curves to detect changes in mouse lung structure in two common lung pathologies, emphysema and fibrosis. Results showed significant changes in several variables consistent with expected structural changes with these pathologies. This measurement of the lung PV curve in mice thus provides a straightforward means to monitor the progression of the pathophysiologic changes over time and the potential effect of therapeutic procedures.

Here we present a protocol to simply and reliably measure the lung pressure-volume curve in mice, showing that it is sufficiently sensitive to detect phenotypic parenchymal changes in two common lung pathologies, pulmonary fibrosis and emphysema. This metric provides a means to quantify the lung&#8217;s structural changes with developing pathology.

Die Messung der Druck-Volumen-Kurve in der Mäuselunge

In recent decades the mouse has become the primary animal model of a variety of lung diseases. In models of emphysema or fibrosis, the essential ...

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer research. Although there are a number of methods that have been published showing how to intubate mice for pulmonary function measurements, none are without potential problems for rapid tracheal instillation in large cohorts of mice. In the present paper, a simple and quick method is described that enables an investigator to carry out such instillations in an efficient manner. The method does not require any special tools or lighting and can be learned with very little practice. It involves anesthetizing a mouse, making a small incision in the neck to visualize the trachea, and then inserting an intravenous catheter directly. The small incision is quickly closed with tissue adhesive, and the mice are allowed to recover. A skilled student or technician can do instillations at an average rate of 2 min/mouse. Once the cancer is established, there is frequently a need for quantitative histologic analysis of the lungs. Traditionally pathologists usually do not bother to standardize lung inflation during fixation, and analyses are often based on a scoring system that can be quite subjective. While this may sometime be sufficiently adequate for gross estimates of the size of a lung tumor, any proper stereological quantification of lung structure or cells requires a reproducible fixation procedure and subsequent lung volume measurement. Here we describe simple reliable procedures for both fixing the lungs under pressure and then accurately measuring the fixed lung volume. The only requirement is a laboratory balance that is accurate over a range of 1 mg&#8211;300 g. The procedures presented here thus could greatly improve the ability to create, treat, and analyze lung cancers in mice.

The goal of this paper is to describe simple methods that will greatly aid in the setup and analysis of mouse lungs with lung cancer or other pathologies. We present 3 protocols to simply and reliably carry out lung instillations, fixation, and lung volume measurements.

Instillation und Fixationsmethoden Nützlich in Maus Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese individuals worldwide by 2030, thus representing a growing socioeconomic burden. Simultaneously, obesity-related comorbidities, including diabetes as well as heart and chronic lung diseases, are continuously on the rise. Although obesity has been associated with increased risk for asthma exacerbations, worsening of respiratory symptoms, and poor control, the functional role of obesity and perturbed metabolism in the pathogenesis of chronic lung disease is often underestimated, and underlying molecular mechanisms remain elusive. This article aims to present methods to assess the effect of obesity on metabolism, as well as lung structure and function. Here, we describe three techniques for mice studies: (1) assessment of intraperitoneal glucose tolerance (ipGTT) to analyze the effect of obesity on glucose metabolism; (2) measurement of airway resistance (Res) and respiratory system compliance (Cdyn) to analyze the effect of obesity on lung function; and (3) preparation and fixation of the lung for subsequent quantitative histological assessment. Obesity-related lung diseases are probably multifactorial, stemming from systemic inflammatory and metabolic dysregulation that potentially adversely influence lung function and the response to therapy. Therefore, a standardized methodology to study molecular mechanisms and the effect of novel treatments is essential.

The incidence of obesity is rising and increases the risk of chronic lung diseases. To establish the underlying mechanisms and preventive strategies, well-defined animal models are needed. Here, we provide three methods (glucose-tolerance-test, body plethysmography, and lung fixation) to study the effect of obesity on pulmonary outcomes in mice.

Intraperitoneale Glucose-Toleranz-Test, Messung der Lungenfunktion und Fixierung der Lunge, um die Auswirkungen von Übergewicht und beeinträchtigter Stoffwechsel auf pulmonale Ergebnisse studieren

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Immunologie und Infektion

Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of thoracic malignancies, additional animal models that can recapitulate diverse human lung cancer subtypes and stages are needed. Allograft or xenograft models are versatile and enable the quantification of tumorigenic capacity in vivo, using malignant cells of either murine or human origin. However, previously described methods of lung cancer cell engraftment have been performed in non-physiological sites, such as the flank of mice, due to the inefficiency of orthotopic transplantation of cells into the lungs. In this study, we describe a method to enhance orthotopic lung cancer cell engraftment by pre-conditioning the airways of mice with the fibrosis inducing agent bleomycin. As a proof-of-concept experiment, we applied this approach to engraft tumor cells of the lung adenocarcinoma subtype, obtained from either mouse or human sources, into various strains of mice. We demonstrate that injuring the airways with bleomycin prior to tumor cell injection increases the engraftment of tumor cells from 0-17% to 71-100%. Significantly, this method enhanced lung tumor incidence and subsequent outgrowth using different models and mouse strains. In addition, engrafted lung cancer cells disseminate from the lungs into relevant distant organs. Thus, we provide a protocol that can be used to establish and maintain new orthotopic models of lung cancer with limiting amounts of cells or biospecimen and to quantitatively assess the tumorigenic capacity of lung cancer cells in physiologically relevant settings.

We describe a method to significantly enhance orthotopic engraftment of lung cancer cells into the murine lungs by pre-conditioning the airways with injury. This approach may also be applied to study stromal interactions within the lung microenvironment, metastatic dissemination, lung cancer co-morbidities, and to more efficiently generate patient derived xenografts.

Die Atemwege von Mäusen mit Bleomycin Vorklimatisierung erhöht die Effizienz der Orthotopen Lung Cancer Cell Engraftment

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of ...

<meta charset="utf8"></head><body>Echtzeit-Überwachung der zellulären Dynamik bei der Lungentransplantation von Mäusen

Intravital Two-Photon Microscopy of the Transplanted Mouse Lung

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by crosstalk between donor and recipient cells. A better understanding of these processes relies on the use of preclinical animal models and is aided by an ability to study intra-graft immune cell trafficking in real-time. Intravital two-photon microscopy can be used to image tissues and organs for depths up to several hundred microns with minimal photodamage, which affords a great advantage over single-photon confocal microscopy. Selective use of transgenic mice with promoter-specific fluorescent protein expression and/or adoptive transfer of fluorescent dye-labeled cells during intravital two-photon microscopy allows for the dynamic study of single cells within their physiologic environment. Our group has developed a technique to stabilize mouse lungs, which has enabled us to image cellular dynamics in na&#239;ve lungs and orthotopically transplanted pulmonary grafts. This technique allows for detailed assessment of cellular behavior within the vasculature and in the interstitium, as well as for examination of interactions between various cell populations. This procedure can be readily learned and adapted to study immune mechanisms that regulate inflammatory and tolerogenic responses after lung transplantation. It can also be expanded to the study of other pathogenic pulmonary conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der Immunologie von Lungentransplantationen durch Intravitalbildgebung

Here, we present a protocol to intravitally image the transplanted mouse left lung using two-photon microscopy. This represents a valuable tool for studying cellular dynamics and interactions in real-time following murine lung transplantation.

Intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie der transplantierten Mauslunge

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by ...