Name: osteoarthritis pain model induced by intra-articular injection of mono-iodoacetate in rats
Uploaded: 2020-05-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Osteoarthritis Pain Model Induced by Intra-Articular Injection of Mono-Iodoacetate in Rats at JoVE.com

Diese Studie wurde von der Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (Grant-Nr.: LY17H270016), der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nr.: 81774331, 81873049 und 81673997) und dem Zhejiang Provincial Science and Technology Project of Traditional Chinese Medicine of China (Grant-Nr.: 2013ZQ007 und 2016ZZ011) finanziert.

Verfahren mit Tieren wurden von der Kommission für medizinische Normen und Ethik der Zhejiang Chinese Medical University genehmigt und entsprechen den chinesischen Rechtsvorschriften über die Verwendung und Pflege von Labortieren.
1. Intraartikuläre Injektion von Monojodacetat in das Knie
<ol><li>Nach einer Woche Akklimatisierung werden 40 männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 180−200 g (4−5 Wochen alt) nach dem Zufallsprinzip und gleichmäßig in vier Gruppen (n = 10 Ratten/Gruppe) aufgeteilt. HINWEIS: Ratten in der Kontrollgruppe werden intraartikulär 50 μl Kochsalzlösung injiziert, während Ratten in den Versuchsgruppen mit 0,5, 1,5 oder 3 mg MIA behandelt werden, die in 50 μl Kochsalzlösung gelöst sind.</li>
	<li>Am Tag der Injektion wird die MIA-Lösung in steriler Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) in einer Konzentration von 15, 30 und 60 mg/ml und eine 10%ige Pentobarbitallösung in steriler Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) frisch zubereitet. VORSICHT: MIA hat eine extrem zerstörerische Wirkung auf die Schleimhäute, die oberen Atemwege, das Auge und die Haut und andere Gewebe. Daher werden bei der Zubereitung einer Lösung Maske und Handschuhe empfohlen.</li>
	<li>Anästhesien Ratten durch intraperitoneale Injektion von Ketamin in einer Dosis von 60 mg/kg und Xylazin in einer Dosis von 5 mg/kg (beide in Kochsalzlösung hergestellt). Klemmen Sie die Zehen der Ratte vorsichtig mit einer Pinzette, um die Anästhesie zu bestätigen.</li>
	<li>Legen Sie die Ratte mit dem Rücken nach unten. Rasieren Sie das Knie und wischen Sie den Bereich um das Kniegelenk mit Alkohol ab.</li>
	<li>Halten Sie das Knie in einem 90°-Winkel und legen Sie die weiße Patellasehne unterhalb der Kniescheibe frei. Drücken Sie mit der Fingerspitze auf die Patellasehne, um den Spalt unter der Kniescheibe zu finden.</li>
	<li>Wählen Sie die Verbindung der Lücke und der lateralen Patellasehne als Injektionsstelle. Führen Sie dann die 26 G Nadel etwa 5 mm vertikal in die Stelle ein. Es sollte kein Widerstand zu spüren sein, wenn sich die Nadel im Gelenkraum befindet. HINWEIS: Es ist wichtig, die Nadel senkrecht zur Injektionsstelle zu halten.</li>
	<li>Injizieren Sie 50 μL Kochsalzlösung oder MIA-Lösung in die Gelenkhöhle. Ziehen Sie langsam die Nadel heraus und wickeln Sie ein Stück Gaze um die Injektionsstelle, um Reflux und Leckage zu minimieren. Nach der Anästhesieerholung entfernen Sie die Gaze.</li>
	<li>Das schmerzbedingte Verhalten ist 1, 7, 14, 21, 28 und 35 Tage nach der Injektion wie in Abschnitt 2 beschrieben zu testen.</li>
</ol>2. Verhaltensbeurteilungen
<ol><li>Mechanische Entnahmeschwelle (MWT) ANMERKUNG: Die MWT wurde mit dem von Frey-Test13 gemessen und der Beobachter war blind für die Injektionen, die die Tiere erhalten hatten.<ol><li>Setzen Sie eine Ratte in einen erhöhten Kunststoffkäfig (17 cm x 11 cm x 13 cm) mit einer Maschendrahtbasis, die 50 cm über einem Tisch hängt. Stellen Sie sicher, dass die Testumgebung ruhig ist, und geben Sie der Ratte 30 Minuten Zeit, um sich an die Umgebung anzupassen.</li>
		<li>Drücken Sie die von Frey-Nadel senkrecht auf die plantare Oberfläche der Hinterpfote jeder Ratte. Erhöhen Sie den Druck allmählich (ca. 20 g/s) und linear, bis das Pfotenheben oder Pfotenlecken erfolgt.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Kraft, die niedriger als der vorherige Schwellenwert ist, um sicherzustellen, dass der Schwellenwert die minimale Rückzugskraft ist. Testen Sie jede Ratte mehr als dreimal, mindestens 3-5 Minuten auseinander.</li>
		<li>Notieren Sie die minimale Kraft, die einen Pfotenrückziehreflex hervorruft. Mittelwert der Daten als MWT von Ratten.</li>
	</ol></li>
	<li>Thermische Entnahmelatenz (TWL) ANMERKUNG: Die TWL wurde mit dem plantaren Testgerät (Materialtabelle) gemessen, und der Beobachter war blind für die Injektionen, die die Tiere erhalten hatten.<ol><li>Stellen Sie eine Plexiglasbox (60 cm x 20 cm x 14 cm, unterteilt in 6 Fächer) auf eine 3 mm dicke Glasplatte und legen Sie Ratten in die Box (eine in jedem Fach). Stellen Sie sicher, dass die Umgebung ruhig ist und die Raumtemperatur konstant ist.</li>
		<li>Geben Sie den Ratten 30 Minuten Zeit, um sich an die Testumgebung zu gewöhnen.</li>
		<li>Kalibrieren Sie den thermischen Reiz über das Infrarot-Radiometer. Stellen Sie die gewünschte Infrarotintensität auf 70 Einheiten ein.</li>
		<li>Platzieren Sie den Infrarot-Sender/-Detektor auf dem Behälter direkt unter der Mitte der zu testenden Pfote.</li>
		<li>Drücken Sie die START-Taste . Der Timer startet automatisch. Der Controller schaltet das Infrarotlicht automatisch aus und stoppt den Timer vollständig, sobald die Pfote bewegt wird.</li>
		<li>Notieren Sie die Reaktionszeit beim Auftreten von Pfotenrückzug und Pfotenlecken. HINWEIS: Eine positive Antwort auf den Test gilt als Pfotenentzug und Pfotenlecken. Wenn nur ein Pfotenentzug auftritt, sollte dies eher als eine willkürliche Bewegung der Ratte als als eine positive Reaktion angesehen werden.</li>
		<li>Wiederholen Sie den Test mehr als dreimal. Berechnen Sie den Durchschnitt der Daten als TWL von Ratten. HINWEIS: Jede Strahlungswärmeeinwirkung sollte 20 s nicht überschreiten. Infrarot-Stimulationen an derselben Hinterpfote sollten mindestens 3-5 Minuten voneinander entfernt sein.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse von Gangmustern HINWEIS: Die Gangbildanalysen wurden mit einem bildgebenden System (Table of Materials) gemessen und der Beobachter wurde für die Injektionen, die die Tiere erhalten hatten, blind gemacht.<ol><li>Stellen Sie die Länge des Laufabteils ein, indem Sie die Knöpfe an beiden Enden des Laufabteils auf eine für Ratten geeignete Länge (z. B. 61 cm) verwenden.</li>
		<li>Setzen Sie eine Ratte in das Laufabteil und trainieren Sie Ratten, um vor dem formalen Experiment mindestens 5 Schrittzyklen mit einer Geschwindigkeit von 18 cm/s ununterbrochen zu laufen. HINWEIS: Wenn eine Ratte zum ersten Mal in den Laufraum gesetzt wird, kann die Geschwindigkeit auf ca. 20 cm/s eingestellt und abgeschaltet werden, wenn sie ca. 2 s läuft. Stellen Sie dann die Geschwindigkeit auf 18 cm/s ein. Klopfen Sie vorsichtig mit der Trennwand auf den Rücken der Ratte, wenn die Ratte während des Gehens pausiert oder sich zurückzieht. Versuchen Sie, die Geschwindigkeit schrittweise von 18 cm/s auf 10 cm/s zu reduzieren. Wenn die Ratte den Test schließlich nicht durchführt, ist es akzeptabel, eine andere Ratte für den Test zu wählen.</li>
		<li>Erhöhen Sie langsam die Geschwindigkeit des Laufbandes, bis es die Zielgeschwindigkeit (18 cm/s) erreicht. Nehmen Sie mit der digitalen Hochgeschwindigkeits-Videokamera, die unter dem transparenten Laufbandgurt montiert ist, mindestens 5 Sekunden lang ein Video der kontinuierlichen Bewegung der Ratte auf.</li>
		<li>Testen Sie jede Ratte im Abstand von mindestens 5 Minuten, um mindestens drei ununterbrochene Läufe zu erhalten.</li>
		<li>Zeichnen Sie einen "Begrenzungsrahmen", um die Grenze des Tierlaufbildes in der Bildbearbeitungssoftware zu definieren, und geben Sie die Ausführungsgeschwindigkeit für jedes Video ein. Wählen Sie Videos als Gruppe aus und verarbeiten Sie Videos automatisch von der Software. Nach der Verarbeitung von Videos gibt die Software mehrere Tabellenkalkulationen aus, um Gangindizes zu melden, einschließlich Stand, Schwung, Bremsen, Antrieb, Trittfrequenz, Schrittfolge usw.</li>
		<li>Berechnen Sie die Gesamtpfotenfläche (cm 2), die durchschnittliche Schrittlänge (cm) und die Schrittlänge der Einheit. HINWEIS: Die Gesamtpfotenfläche ist der Mittelwert der Gesamtfläche von vier Pfoten jeder Rattengruppe und die Pfotenfläche ist definiert als die maximale Pfotenfläche, die während der Standphase des Schrittzyklus mit dem Laufband in Kontakt kommt. Die Schrittlänge ist der Abstand zwischen den ersten Kontakten derselben Pfote in einem vollständigen Schritt. Einheit Schrittlänge = durchschnittliche Schrittlänge (cm)/Körperlänge (cm).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Histopathologische und immunhistochemische Analysen
<ol><li>Euthanasieren von Ratten durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbitalnatrium in einer Dosis von 150 mg/kg (in Kochsalzlösung hergestellt). Resektionieren Sie die Kniegelenke sofort für die histologischen Analysen.</li>
	<li>Fixieren Sie die Fugen in 10% Formalin für 24 h, entkalken Sie mit 10% EDTA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 8 Wochen und betten Sie dann die Fugen in Paraffin ein. VORSICHT: Formalin kann Augen-, Haut- und Atemwegsreizungen verursachen. Es sollte in einer Kapuze gehandhabt werden.</li>
	<li>Die in 3 mm dicken Paraffinfugen werden mit einem Mikrotom geschnitten und in einem 40 °C warmen Wasserbad mit destilliertem Wasser schwimmen.</li>
	<li>Übertragen Sie Schnitte auf Objektträger. Trocknen Sie die Objektträger über Nacht und lagern Sie sie bei Raumtemperatur (RT), um die anschließende Färbung fortzusetzen.</li>
	<li>Die Objektträger für 4 h in einen 60 °C heißen Ofen geben, um sie zu entparaffinieren.</li>
	<li>Tauchen Sie die Objektträger nacheinander in Xylol, Xylol, 100% Ethanol, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 80% Ethanol und 75% Ethanol für jeweils 5 min bei RT.</li>
	<li>Färbungsschnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H&E), Safranin-O (SO) und Alcianblau-Hämatoxylin (ABH) sowie Antikörpern gegen Rattenkollagen Typ II (Col2), Kollagen Typ X (Col10) und Matrix-Metalloproteinase 13 (MMP13), wie in den Schritten 3.8−3.12 beschrieben.</li>
	<li>H&E-Färbung<ol><li>Spülen Sie Objektträger mit deionisiertemH2Ofür 3 min. Objektträger mit Hämatoxylin für 3−5 Min. einfärben.</li>
		<li>Spülen Sie Objektträger mit deionisiertemH2O3x, jeweils 1 min, bis kein Hämatoxylin mehr auf der Oberfläche verbleibt.</li>
		<li>Färben Sie Objektträger mit Eosin für 30 s. Anschließend werden die Objektträger mit deionisiertemH2O3x jeweils 1 min gespült, bis kein Eosin mehr auf der Oberfläche verbleibt.</li>
		<li>Die Objektträger werden 10−20 s lang in 0,1 % Ammoniak getaucht. Anschließend werden die Objektträger mit deionisiertemH2O3x jeweils 1 min gespült.</li>
		<li>Die Objektträger werden nacheinander für 1 Minute in 95% Ethanol, 100% Ethanol, Xylol, Xylol und Xylol eingetaucht.</li>
		<li>Deckglas der Objektträger mit neutralem Harz.</li>
	</ol></li>
	<li>SO-Färbung<ol><li>Spülen Sie Objektträger mit deionisiertemH2Ofür 3 min. Objektträger mit Hämatoxylin für 3−5 Min. einfärben.</li>
		<li>Schnell differenzieren in 1% saurem Alkohol (ca. 3 s). Anschließend werden die Objektträger mit deionisiertemH2O3x jeweils 1 min gespült, bis kein Hämatoxylin mehr auf der Oberfläche verbleibt.</li>
		<li>Fleckenobjektträger mit Fast Green (FCF) Lösung für 5 min. Anschließend werden die Objektträger mit deionisiertemH2O3x jeweils 1 min gespült.</li>
		<li>Färben Sie Objektträger mit SO für 1−2 min. Anschließend werden die Objektträger mit deionisiertemH2O3x jeweils 1 min gespült.</li>
		<li>Spülen Sie die Objektträger 1−2 min lang mit 1%iger Essigsäure ab, um den Rest-FCF zu entfernen. Spülen Sie Objektträger mit deionisiertemH2Ofür 1 min.</li>
		<li>Die Objektträger werden nacheinander für 1 Minute in 95% Ethanol, 100% Ethanol, Xylol, Xylol und Xylol eingetaucht.</li>
		<li>Deckglas der Objektträger mit neutralem Harz.</li>
	</ol></li>
	<li>ABH-Färbung<ol><li>Spülen Sie Objektträger mit deionisiertemH2Ofür 3 min. Die Objektträger 30 s in 1%igen Säurealkohol eintauchen und kurz auf einem Küchenpapier abtropfen lassen (nicht ausspülen).</li>
		<li>Dias 1 Stunde lang in ABH eintauchen. Anschließend werden die Objektträger mit deionisiertemH2O3x jeweils 1 min gespült, bis kein ABH mehr auf der Oberfläche verbleibt.</li>
		<li>Schnell differenzieren in 1% saurem Alkohol (ca. 3 s). Spülen Sie Objektträger mit deionisiertemH2O3x, jeweils 1 min.</li>
		<li>Tauchen Sie die Objektträger für 15 s in 0,5% Ammoniumwasser. Anschließend werden die Objektträger mit deionisiertemH2O3x jeweils 1 min gespült.</li>
		<li>Objektträger 1 Minute lang in 95%iges Ethanol eintauchen. Die Objektträger 1,5 Minuten lang in Eosin/Orange G-Lösung eintauchen.</li>
		<li>Die Objektträger werden nacheinander für 1 Minute in 95% Ethanol, 100% Ethanol, Xylol, Xylol und Xylol eingetaucht.</li>
		<li>Deckglas der Objektträger mit neutralem Harz.</li>
	</ol></li>
	<li>Untersuchen Sie alle Objektträger unter einem Mikroskop und bewerten Sie sie statistisch auf einer Skala von 0-13 durch Doppelblindbeobachtung gemäß Mankins Bewertungssystem14.</li>
	<li>Immunhistochemie<ol><li>Spülen Sie Objektträger mit deionisiertemH2Ofür 3 min.</li>
		<li>Die Objektträger werden in 0,1 M Natriumcitrat getaucht und für 4 h in einen 60 °C-Ofen gestellt, um das Antigen zu entnehmen.</li>
		<li>Dias 10 Minuten lang in 0,3% Triton X-100 in PBS eintauchen. Anschließend die Objektträger 2x mit PBS abspülen, jeweils 3 min.</li>
		<li>Abschnitte in 3%igerH2O2-Lösungin Methanol bei RT für 10 min inkubieren, um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren. Spülen Sie die Objektträger mit PBS 2x, je 3 min.</li>
		<li>Inkubieren Sie Schnitte mit 5% Ziegenserum in PBS für 30 min bei RT, um unspezifische Bindungen zu blockieren. Spülen Sie die Objektträger mit PBS 2x, je 3 min.</li>
		<li>Schnitte werden über Nacht bei 4 °C mit 100 μL PBS-verdünnten (1:1.000) Primärantikörpern gegen Rattenkollagen Typ II (Col2), Kollagen Typ X (Col10) und Matrix-Metalloproteinase 13 (MMP13) inkubiert. Spülen Sie die Objektträger mit PBS 2x, je 3 min.</li>
		<li>Inkubieren Sie Schnitte mit 100 μL PBS-verdünntem (1:1.000) sekundärem Antikörper (Ziegen-Anti-Maus-sekundär oder Ziegen-Anti-Maus-Sekundäranti-Maus-Sekundär) für 20 min bei RT. Spülen Sie die Objektträger mit PBS 2x, jeweils 3 min.</li>
		<li>Inkubieren Sie Abschnitte mit 100 μL 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) Arbeitslösung. Beobachten Sie die Reaktion, während die chromogene Reaktion die Epitopstellen braun färbt. VORSICHT: DAB ist krebserregend. Tragen Sie immer Handschuhe und arbeiten Sie in einer Kapuze, wenn Sie mit DAB arbeiten. HINWEIS: Die Zeit der Farbentwicklung kann von wenigen Sekunden bis zu 10 Minuten variieren.</li>
		<li>Sobald sich eine braune Farbe auf den Abschnitten entwickelt, spülen Sie die Objektträger mit deionisiertem H2O 2x, jeweils 3 min.</li>
		<li>Tauchen Sie die Objektträger für 1-2 Minuten in Hämatoxylin, um die Objektträger gegenzufärben. Anschließend werden die Objektträger mit deionisiertemH2O3x jeweils 1 min gespült.</li>
		<li>Die Objektträger werden nacheinander für 1 Minute in 95% Ethanol, 100% Ethanol, Xylol, Xylol und Xylol eingetaucht.</li>
		<li>Deckglas der Objektträger mit neutralem Harz.</li>
		<li>Beobachten Sie die Farbe der Antikörperfärbung in den Schnitten unter einem Mikroskop.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eupatilin+Exerts+Antinociceptive+and+Chondroprotective+Properties+in+a+Rat+Model+of+Osteoarthritis+by+Downregulating+Oxidative+Damage+and+Catabolic+Activity+in+Chondrocytes.">Eupatilin Exerts Antinociceptive and Chondroprotective Properties in a Rat Model of Osteoarthritis by Downregulating Oxidative Damage and Catabolic Activity in Chondrocytes.</a> PLoS ONE. 10 (6), 0130882 (2015).</li><li>Cook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+cartilage+repair.">Animal models of cartilage repair.</a> Bone &amp; Joint Research. 3 (4), 89-94 (2014).</li><li>Little, C. B., Zaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+constitutes+an+"animal+model+of+osteoarthritis"--the+need+for+consensus.">What constitutes an "animal model of osteoarthritis"--the need for consensus.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 20 (4), 261-267 (2012).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das Rattenmodell der durch MIA induzierten OA ist ein gut etabliertes, weit verbreitetes Modell. Die intraartikuläre Injektion von MIA verursacht zunächst eine schwere und akute Entzündung, die zu der längeren und degenerativen Phase von OA17,18 führt. In dieser Studie haben wir die nozizeptive Empfindlichkeit von MWT und TWL gemessen und Gangveränderungen mit einem Bildgebungssystem bewertet. Frühere Berichte ergaben, dass die Injektion von MIA die Empfin...

Osteoarthritis (OA) ist die häufigste Gelenkerkrankung der Welt und betrifft schätzungsweise 10-12% der Erwachsenen1. Das am häufigsten betroffene Gelenk ist das Knie, und OA hat eine höhere Inzidenz bei älteren Erwachsenen, insbesondere bei Frauen2. Als chronische Erkrankung entwickelt sich OA über Jahrzehnte fortschreitend zu Gelenkversagen mit Symptomen wie Knorpelverlust, Synovialentzündung, Osteophytose, verminderter Funktion und chronischen Schmerzen3. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) ist OA die vierthäufigste Krankheit bei Frauen und die achthäufigste Krankheit bei Männern. Bis 2020 könnte OA die vierthäufigste behindernde Krankheit beim Menschen werden4. Die derzeit verfügbaren Therapien der OA behandeln jedoch nur die Symptome und verlängern die Zeit bis zur Gelenkersatzoperation5.
Die spontane Arthrose bei menschlichen Patienten dauert oft lange, bis sie klinische Symptome wie Gelenkschmerzen hervorruft6. In den frühen Stadien der OA sind die Schmerzen in der Regel intermittierend und werden mit fortschreitender Krankheit häufiger und schwerer, was sie zur vorherrschenden Beschwerde der Patienten macht7. Daher wurden im letzten halben Jahrhundert umfangreiche Tiermodelle für OA-Schmerzen entwickelt, um die Schmerzlinderungstherapie zu fördern. Open-Access-Modelle wurden klassischerweise in spontane und induzierte Modelle unterteilt. Zu den spontanen Modellen gehören natürlich vorkommende Modelle und genetisch veränderte Modelle, die den Verlauf der primären OA beim Menschen genauer simulieren können8. Induzierte Modelle können im Allgemeinen in zwei Kategorien unterteilt werden: 1) posttraumatische OA, die durch eine Operation oder ein anderes Trauma induziert wird; oder 2) intraartikuläre Injektion von chondrotoxischen oder entzündungsfördernden Substanzen3. Diese Modelle bilden die Grundlage für die pathophysiologische Untersuchung von OA und tragen wesentlich zur Entwicklung von Medikamenten zur Schmerzlinderung und Funktionssteigerung bei.
In jüngster Zeit ist Mono-Iodacetat (MIA) der am weitesten verbreitete Induktor für die OA-Modellierung. MIA, ein Inhibitor der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, kann Veränderungen in der Knorpelmatrix, Abbau, Knorpelverlust, Synovitis und andere Veränderungen verursachen, die den pathologischen Veränderungen der menschlichen Arthrose ähneln9. Es wurde festgestellt, dass die intraartikuläre Injektion von MIA 28 Tage nach der MIA-Verabreichung anhaltende Schmerzen induzierte, was darauf hindeutet, dass das MIA-Modell für die Untersuchung chronischer nozizeptiver Schmerzen nützlich sein kann10,11,12. In dieser Studie erhielten männliche Sprague-Dawley-Ratten intraartikuläre Injektionen mit 0,5, 1,5 oder 3 mg MIA in die Kniegelenke. Der Schweregrad der MIA-induzierten Gelenkschmerzen wurde durch Beurteilung der mechanischen und thermischen Empfindlichkeit 1, 7, 14, 21, 28 und 35 Tage nach der Injektion gemessen. Auf dieser Grundlage wurden 1,5 mg MIA als Endkonzentration ausgewählt, um Gangmuster und histologische Veränderungen 28 Tage nach der Injektion zu bewerten.

<table><tbody><tr><td>Anti-Collagen II antibody</td><td>Abcam(UK)</td><td>34712</td><td>Primary antibody for immunohistochemistry (IHC)</td></tr><tr><td>Anti-Collagen X (Col10) antibody</td><td>Abcam(UK)</td><td>49945</td><td>Primary antibody for IHC</td></tr><tr><td>DigiGait Imaging System</td><td>Mouse Specifics (Boston, MA, USA)</td><td></td><td>Equipment for gait patterns analyses</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861006</td><td>The dye for HE staining</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td>The dye for SO staining</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse antibody</td><td>ZSGQ-BIO (Beijing, China)</td><td>PV-9002</td><td>Secondary antibody for IHC</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit antibody</td><td>ZSGQ-BIO (Beijing, China)</td><td>PV-9001</td><td>Secondary antibody for IHC</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3163</td><td>The dye for HE staining</td></tr><tr><td>MIA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4386-10G</td><td>powder</td></tr><tr><td>MMP13</td><td>Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)</td><td>69926</td><td>Primary antibody for IHC</td></tr><tr><td>Modular tissue embedding center</td><td>Thermo Fisher Scientific (USA)</td><td>EC 350</td><td>Produce paraffin blocks.</td></tr><tr><td>Plantar Test apparatus</td><td>UgoBasile (Italy)</td><td>37370</td><td>Equipment for TWL assay</td></tr><tr><td>PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)</td><td>TaKaRa Biotechnology Co. Ltd. (Dalian, China)</td><td>RR037A</td><td>Extracte total RNA from cultured cells</td></tr><tr><td>Rotary and Sliding Microtomes</td><td>Thermo Fisher Scientific (USA)</td><td>HM325</td><td>Precise paraffin sections.</td></tr><tr><td>Safranin-O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2255</td><td>The dye for SO staining</td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 5 Jr</td><td>Sakura (Japan)</td><td></td><td>Vacuum Infiltration Processor</td></tr></tbody></table>

osteoarthritis pain model induced by intra-articular injection of mono-iodoacetate in rats

Die aktuellen Tiermodelle der Arthrose (OA) lassen sich in spontane Modelle und induzierte Modelle unterteilen, die beide darauf abzielen, die pathophysiologischen Veränderungen der menschlichen OA zu simulieren. Als Hauptsymptom im Spätstadium der OA beeinträchtigen Schmerzen jedoch das tägliche Leben der Patienten, und es gibt nicht viele verfügbare Modelle. Das Monojodacetat (MIA)-induzierte Modell ist das am weitesten verbreitete OA-Schmerzmodell, das hauptsächlich bei Nagetieren eingesetzt wird. MIA ist ein Inhibitor der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, die Chondrozytentod, Knorpeldegeneration, Osteophyten und messbare Veränderungen im Verhalten der Tiere verursacht. Darüber hinaus können Expressionsänderungen der Matrix-Metalloproteinase (MMP) und proinflammatorischer Zytokine (IL1-β und TNF-α) im MIA-induzierten Modell nachgewiesen werden. Diese Veränderungen stehen im Einklang mit den pathophysiologischen Bedingungen der OA beim Menschen, was darauf hindeutet, dass MIA ein messbares und erfolgreiches OA-Schmerzmodell induzieren kann. Diese Studie zielt darauf ab, die Methodik der intraartikulären Injektion von MIA bei Ratten zu beschreiben und die daraus resultierenden schmerzbezogenen Verhaltensweisen und histopathologischen Veränderungen zu diskutieren.

Mit dieser Methodik etablierten wir ein OA-Schmerzmodell in der Ratte und erkannten die daraus resultierenden Veränderungen. MWT und TWL spiegelten mechanische Allodynie bzw. thermische Hyperalgesie wider. Wie in Abbildung 1 dargestellt, induzierten MIA mechanische Allodynie und thermische Hyperalgesie in dosisabhängiger Weise. Bemerkenswert ist, dass die Abnahme der MWT einen Höhepunkt von 21 Tagen auf 28 Tage erreichte und sich dann wieder erholte, was darauf hindeutet, dass in diesem S...

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Osteoarthritis Pain Model Induced by Intra-Articular Injection of Mono-Iodoacetate in Rats

Diese Studie beschreibt die Methode der intraartikulären Injektion von Monojodacetat bei Ratten und diskutiert die daraus resultierenden schmerzbezogenen Verhaltensweisen und histopathologischen Veränderungen, die Referenzen für zukünftige Anwendungen liefern.

Osteoarthritis-Schmerzmodell, induziert durch intraartikuläre Injektion von Mono-Jodacetat bei Ratten

The current animal models of osteoarthritis (OA) can be divided into spontaneous models and induced models, both of which aim to simulate the ...

osteoarthritis-pain-model-induced-intra-articular-injection-mono

Research

JoVE Journal

Medicine

8.1K Aufrufe.  Zhejiang Chinese Medical University. Diese Studie beschreibt die Methode der intraartikulären Injektion von Monojodacetat bei Ratten und diskutiert die daraus resultierenden schmerzbezogenen Verhaltensweisen und histopathologischen Veränderungen, die Referenzen für zukünftige Anwendungen liefern.

Serie: Osteoarthritis Pain Model Induced by Intra-Articular Injection of Mono-Iodoacetate in Rats

Chronic Constriction of the Sciatic Nerve and Pain Hypersensitivity Testing in Rats

Chronic neuropathic pain, resulting from damage to the central or peripheral nervous system, is a prevalent and debilitating condition, affecting 7-18% of the population1,2. Symptoms include spontaneous (tingling, burning, electric-shock like) pain, dysaesthesia, paraesthesia, allodynia (pain resulting from normally non-painful stimuli) and hyperalgesia (an increased response to painful stimuli). The sensory symptoms are co-morbid with behavioural disabilities, such as insomnia and depression. To study chronic neuropathic pain several animal models mimicking peripheral nerve injury have been developed, one of the most widely used is Bennett and Xie's (1988) unilateral sciatic nerve chronic constriction injury (CCI)3 (Figure 1). Here we present a method for performing CCI and testing pain hypersensitivity.
CCI is performed under anaesthesia, with the sciatic nerve on one side exposed by making a skin incision, and cutting through the connective tissue between the gluteus superficialis and biceps femoris muscles. Four chromic gut ligatures are tied loosely around the sciatic nerve at 1 mm intervals, to just occlude but not arrest epineural blood flow. The wound is closed with sutures in the muscle and staples in the skin. The animal is then allowed to recover from surgery for 24 hrs before pain hypersensitivity testing begins.
For behavioural testing, rats are placed into the testing apparatus and are allowed to habituate to the testing procedure. The area tested is the mid-plantar surface of the hindpaw (Figure 2), which falls within the sciatic nerve distribution. Mechanical withdrawal threshold is assessed by mechanically stimulating both injured and uninjured hindpaws using an electronic dynamic plantar von Frey aesthesiometer or manual von Frey hairs4. The mechanical withdrawal threshold is the maximum pressure exerted (in grams) that triggers paw withdrawal. For measurement of thermal withdrawal latency, first described by Hargreaves et al (1988), the hindpaw is exposed to a beam of radiant heat through a transparent glass surface using a plantar analgesia meter5,6. The withdrawal latency to the heat stimulus is recorded as the time for paw withdrawal in both injured and uninjured hindpaws. Following CCI, mechanical withdrawal threshold, as well as thermal withdrawal latency in the injured paw are both significantly reduced, compared to baseline measurements and the uninjured paw (Figure 3). The CCI model of peripheral nerve injury combined with pain hypersensitivity testing provides a model system to investigate the effectiveness of potential therapeutic agents to modify chronic neuropathic pain. In our laboratory, we utilise CCI alongside thermal and mechanical sensitivity of the hindpaws to investigate the role of neuro-immune interactions in the pathogenesis and treatment of neuropathic pain.

Due to the simplicity of surgery and the robust behavioural outcome, chronic constriction of the sciatic nerve is one of the pre-eminent animal models of neuropathic pain. Within 24 hrs following surgery, pain hypersensitivity is established and can be quantitatively measured using a von Frey aesthesiometer (mechanical test) and plantar analgesia meter (thermal test).

Chronische Verengung des Ischiasnerv und Schmerzen Überempfindlichkeit Testing in Ratten

Chronic neuropathic pain, resulting from damage to the central or peripheral nervous system, is a prevalent and debilitating condition, affecting 7-18% of ...

Forschung

Medizin

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Modell Netzhautablösung in Nagetiere durch subretinale Injektion von Natriumhyaluronat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present here a protocol for elevating intraocular pressure (IOP) in the rat, by injecting magnetic microspheres into the anterior chamber of the eye. The use of magnetic particles allows the user to manipulate the beads into the iridocorneal angle, thus providing a very effective blockade of fluid outflow from the trabecular meshwork. This leads to long-lasting IOP rises, and eventually neuronal death in the ganglion cell layer (GCL) as well as optic nerve pathology, as seen in patients with the disease. This method is simple to perform, as it does not require machinery, specialist surgical skills, or many hours of practice to perfect. Furthermore, the pressure elevations are very robust, and reinjection of the magnetic microspheres is not usually required unlike in some other models using plastic beads. Additionally, we believe this method is suitable for adaptation for the mouse eye.

We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

Experimentelle Glaukom von Ocular Injektion von magnetischen Mikrokügelchen Induzierte

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present ...

Inflammatory TMJ Pain Mouse Model: Bite Force and Von Frey Filament Assessments

Temporomandibular Joint Pain Measurement by Bite Force and Von Frey Filament Assays in Mice

Temporomandibular joint (TMJ) pain and osteoarthritis (OA) are common and debilitating disorders that impair patients' quality of life. The mechanisms driving diseases-related pain are poorly understood, and current treatments fail to provide effective and long-term therapeutic effects. Additionally, pain assessment in research, particularly orofacial pain, poses several challenges that complicate studies in both clinical and basic science settings. Therefore, we have established an inflammatory TMJ pain mouse model via intra-articular injection of CFA (Complete Freund's Adjuvant) and evaluated pain behaviors by bite force measurement and the von Frey filament test. Mice with CFA injection exhibited orofacial pain behaviors compared to PBS injection, including reduced bite force and head withdrawal threshold in the von Frey filament test. These methods are relatively easy to execute to have reproducible results and can be potentially extended to pain studies for other disease models related to TMJ disorders. Together, bite force, and the von Frey filament tests are reliable in measuring orofacial pain, as demonstrated in CFA injection-induced painful TMJOA mouse models.

This protocol describes how measuring bite force and head withdrawal threshold can capture pain behavior in Complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced inflammatory temporomandibular joint (TMJ) pain.

Temporomandibular joint (TMJ) pain and osteoarthritis (OA) are common and debilitating disorders that impair patients' quality of life. The mechanisms ...

Verhalten

The Monoiodoacetate Model of Osteoarthritis Pain in the Mouse

A major symptom of patients with osteoarthritis (OA) is pain that&#160;is triggered by peripheral as well as central changes within the pain pathways. The current treatments for OA pain such as NSAIDS or opiates are neither sufficiently effective nor devoid of detrimental side effects. Animal models of OA are being developed to improve our understanding of OA-related pain mechanisms and define novel pharmacological targets for therapy. Currently available models of OA in rodents include surgical and chemical interventions into one knee joint. The monoiodoacetate (MIA) model has become a standard for modelling joint disruption in OA in both rats and mice. The model, which is easier to perform in the rat, involves injection of MIA into a knee joint that induces rapid pain-like responses in the ipsilateral limb, the level of which can be controlled by injection of different doses. Intra-articular injection of MIA disrupts chondrocyte glycolysis by inhibiting glyceraldehyde-3-phosphatase dehydrogenase and results in chondrocyte death, neovascularization, subchondral bone necrosis and collapse, as well as inflammation. The morphological changes of the articular cartilage and bone disruption are reflective of some aspects of patient pathology. Along with joint damage, MIA injection induces referred mechanical sensitivity in the ipsilateral hind paw and weight bearing deficits that are measurable and quantifiable. These behavioral changes resemble some of the symptoms reported by the patient population, thereby validating the MIA injection in the knee as a useful and relevant pre-clinical model of OA pain.
The aim of this article is to describe the methodology of intra-articular injections of MIA and the behavioral recordings of the associated development of hypersensitivity with a mind to highlight the necessary steps to give consistent and reliable recordings.

Osteoarthritis (OA), or degenerative joint disease, is a debilitating condition associated with pain that remains only partially controlled by available analgesics. Animal models are being developed to improve our understanding of OA-related pain mechanisms. Here we describe the methodology for the monoiodoacetate model of OA pain in the mouse.

Das Monoiodoacetate Modell von Osteoarthritis Schmerzen in der Maus

A major symptom of patients with osteoarthritis (OA) is pain that&#160;is triggered by peripheral as well as central changes within the pain pathways. The ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

Ein Modell des Glaukoms induziert durch Circumlimbal Naht bei Ratten und Mäusen

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

Spontaneous and Evoked Measures of Pain in Murine Models of Monoarticular Knee Pain

Pain is the main cause of disability from arthritis. There is currently an unmet need for adequate treatments for arthritis pain. Pre-clinical models are necessary and useful for studying the mechanisms of pain and for evaluating efficacy of arthritis therapies. Measuring pain in animal models of arthritis is challenging. We have developed methods for measuring evoked and spontaneous pain in three models of murine arthritis. We quantitate the evoked pain responses of mice subjected to firm palpation of a painful knee. We also evaluate spontaneous pain by the proportion of weight and the amount of time placed on each of their 4 limbs after induction of arthritis pain in one knee. Joint pain in these mouse models produces a significant increase in evoked pain responses and an alteration in weight bearing. Since mice are quadrupeds, they offload the painful limb to the contralateral limb, to the forelimbs, or some combination. These methods are simple, require minimal equipment, and are reproducible and sensitive for detecting pain. They are useful for studying both disease-modifying arthritis treatments and analgesics in mice.

We have developed an evoked measure of arthritis pain and coupled it with a standardized method for measuring spontaneous pain in different murine models of chemically induced arthritis. These measures are sensitive and reproducible for different types of joint pain.

Spontan und evozierten Maßnahmen des Schmerzes in murinen Modellen der monoartikulär Knieschmerzen

Pain is the main cause of disability from arthritis. There is currently an unmet need for adequate treatments for arthritis pain. Pre-clinical models are ...

The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in addition to a clinical, functional assessment methodology, including details for further encouragement of the development of non-drug surgical intervention strategies in knee osteoarthritis patients. However, we only present the effect of LBPP training in improvement of pain and knee function in one patient through three-dimensional gait analysis. The exact, long-term effects of this approach should be explored in future studies.

Here, based on a clinician&#8217;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in addition to a clinical, functional assessment methodology, including details for further encouragement of the development of non-drug surgical intervention strategies in knee osteoarthritis patients. However, we only present the effect of LBPP training in improvement of pain and knee function in one patient through three-dimensional gait analysis. The exact, long-term effects of this approach should be explored in future studies.

Das Unterkörper-Positivdruck-Laufband für die Knie-Osteoarthritis-Rehabilitation

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...

Etablierung des KOA-Modells bei Kaninchen mit der modifizierten Videman-Methode

Application of Acupotomy in a Knee Osteoarthritis Model in Rabbit

Knee osteoarthritis (KOA) is one of the most frequently encountered diseases in the orthopedic department, which seriously reduces the quality of life of people with KOA. Among several pathogenic factors, the biomechanical imbalance of the knee joint is one of the main causes of KOA. Acupotomology believes that restoring the mechanical balance of the knee joint is the key to treating KOA. Clinical studies have shown that acupotomy can effectively reduce pain and improve knee mobility by reducing adhesion, contracture of soft tissues, and stress concentration points in muscles and tendons around the knee joint. 
In this protocol, we used the modified Videman method to establish a KOA model by immobilizing the left hindlimb in a straight position. We have outlined the method of operation and the precautions related to acupotomy in detail and evaluated the efficacy of acupotomy in conjunction with the theory of "Modulating Muscles and Tendons to Treat Bone Disorders" through the detection of the mechanical properties of quadriceps femoris and tendon, as well as cartilage mechanics and morphology. The results show that acupotomy has a protective effect on cartilage by adjusting the mechanical properties of the soft tissues around the knee joint, improving the cartilage stress environment, and delaying cartilage degeneration.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung des Wirkmechanismus der Acupotomie bei der Behandlung von Kniearthrose

In this protocol, a knee osteoarthritis model was prepared using the modified Videman method, and the operation procedures and precautions of acupotomy are detailed. The effectiveness of acupotomy has been demonstrated by testing the mechanical properties of quadriceps femoris and tendon and the mechanical and morphological properties of cartilage.

Anwendung der Akumotomie in einem Kniearthrosemodell bei Kaninchen

Knee osteoarthritis (KOA) is one of the most frequently encountered diseases in the orthopedic department, which seriously reduces the quality of life of ...

Osteoarthritis-Schmerzmodell, induziert durch intraartikuläre Injektion von Mono-Jodacetat bei Ratten

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Chronische Verengung des Ischiasnerv und Schmerzen Überempfindlichkeit Testing in Ratten

Modell Netzhautablösung in Nagetiere durch subretinale Injektion von Natriumhyaluronat

Experimentelle Glaukom von Ocular Injektion von magnetischen Mikrokügelchen Induzierte

Temporomandibular Joint Pain Measurement by Bite Force and Von Frey Filament Assays in Mice

Das Monoiodoacetate Modell von Osteoarthritis Schmerzen in der Maus

Ein Modell des Glaukoms induziert durch Circumlimbal Naht bei Ratten und Mäusen

Spontan und evozierten Maßnahmen des Schmerzes in murinen Modellen der monoartikulär Knieschmerzen

Das Unterkörper-Positivdruck-Laufband für die Knie-Osteoarthritis-Rehabilitation

Anwendung der Akumotomie in einem Kniearthrosemodell bei Kaninchen

Anwendung der Akumotomie in einem Kniearthrosemodell bei Kaninchen