Este estudo foi financiado pela Fundação Provincial de Ciências Naturais de Zhejiang da China (Grant No: LY17H270016), pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Grant No: 81774331, 81873049 e 81673997) e pelo Zhejiang Provincial Science and Technology Project of Traditional Chinese Medicine of China (Grant No: 2013ZQ007 e 2016ZZ011).

Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Normas Médicas e Ética da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang e estão de acordo com a legislação da China sobre o uso e cuidado de animais de laboratório.
1. Injeção intra-articular de mono-iodoacetato no joelho
<ol><li>Após uma semana de aclimatação, divida aleatoriamente e igualmente 40 ratos Sprague-Dawley machos pesando 180-200 g (4-5 semanas de idade) em quatro grupos (n = 10 ratos / grupo). NOTA: Os ratos do grupo controle serão injetados intra-articularmente com 50 μL de solução salina, enquanto os ratos dos grupos experimentais serão tratados com 0,5, 1,5 ou 3 mg de MIA dissolvidos em 50 μL de solução salina, respectivamente.</li>
	<li>No dia da injeção, preparar recentemente a solução de MIA em solução salina estéril (NaCl a 0,9%) na concentração de 15, 30 e 60 mg/ml e solução de pentobarbital a 10% em solução salina estéril (NaCl a 0,9%). CUIDADO: MIA tem um efeito extremamente destrutivo sobre a membrana mucosa, o trato respiratório superior, o olho e a pele e outros tecidos. Portanto, máscara e luvas são recomendadas ao preparar uma solução.</li>
	<li>Anestesiar ratos por injeção intraperitoneal de cetamina a 60 mg/kg e xilazina a 5 mg/kg (ambas preparadas em solução salina). Prenda suavemente os dedos dos pés do rato com uma pinça para confirmar a anestesia.</li>
	<li>Coloque o rato com as costas voltadas para baixo. Raspe o joelho e limpe a área ao redor da articulação do joelho com álcool.</li>
	<li>Mantenha o joelho em um ângulo de 90° e revele o tendão patelar branco abaixo da patela. Pressione o tendão patelar com a ponta do dedo para encontrar a lacuna abaixo da patela.</li>
	<li>Escolha a junção do espaço e do tendão patelar lateral como local de injeção. Em seguida, insira a agulha 26 G verticalmente no local cerca de 5 mm. Nenhuma resistência deve ser sentida quando a agulha está no espaço articular. NOTA: É importante manter a agulha perpendicular ao local da injeção.</li>
	<li>Injete 50 μL de solução salina ou MIA na cavidade articular. Puxe lentamente a agulha e enrole um pedaço de gaze ao redor do local da injeção para minimizar o refluxo e o vazamento. Após a recuperação da anestesia, remova a gaze.</li>
	<li>Teste o comportamento relacionado com a dor aos 1, 7, 14, 21, 28 e 35 dias após as injeções, conforme descrito na secção 2.</li>
</ol>2. Avaliações comportamentais
<ol><li>Limiar de retirada mecânica (MWT) NOTA: O TCM foi medido pelo teste de von Frey13 e o observador ficou cego para as injeções que os animais haviam recebido.<ol><li>Coloque um rato em uma gaiola de plástico elevada (17 cm x 11 cm x 13 cm) com uma base de malha de arame suspensa 50 cm acima de uma mesa. Certifique-se de que o ambiente de teste seja silencioso e dê ao rato 30 minutos para se adaptar ao ambiente.</li>
		<li>Pressione a agulha de von Frey perpendicularmente na superfície plantar da pata traseira de cada rato. Aumente a pressão gradualmente (aproximadamente 20 g/s) e linearmente até que ocorra o levantamento da pata ou a lambida da pata.</li>
		<li>Use uma força inferior ao limite anterior para garantir que o limite seja a força mínima de retirada. Teste cada rato mais de três vezes, com pelo menos 3 a 5 minutos de intervalo.</li>
		<li>Registre a força mínima que provoca um reflexo de retirada da pata. Média dos dados como o TCM de ratos.</li>
	</ol></li>
	<li>Latência de retirada térmica (TWL) NOTA: A TWL foi medida utilizando-se o aparelho de teste plantar (Tabela de Materiais) e o observador foi cegado para as injeções que os animais haviam recebido.<ol><li>Coloque uma caixa de plexiglass (60 cm x 20 cm x 14 cm, dividida em 6 compartimentos) em uma placa de vidro de 3 mm de espessura e coloque ratos na caixa (um em cada compartimento). Certifique-se de que o ambiente esteja silencioso e que a temperatura ambiente seja constante.</li>
		<li>Dê aos ratos 30 minutos para se adaptarem ao ambiente de teste.</li>
		<li>Calibre o estímulo térmico através do radiômetro infravermelho. Defina a intensidade infravermelha desejada em 70 unidades.</li>
		<li>Coloque o emissor/detector infravermelho no recipiente diretamente sob o centro da pata que está sendo testada.</li>
		<li>Pressionando o botão START . O temporizador será iniciado automaticamente. O controlador desligará automaticamente a luz infravermelha e interromperá completamente o temporizador assim que o movimento da pata ocorrer.</li>
		<li>Registre o tempo de reação quando o aparecimento de retirada da pata e lamber a pata. NOTA: Uma resposta positiva para o teste é considerada como retirada da pata e lambida da pata. Se apenas a retirada da pata ocorrer, deve ser considerada como um movimento voluntário do rato, em vez de uma resposta positiva.</li>
		<li>Repita o teste mais de três vezes. Média dos dados como o TWL de ratos. NOTA: Cada exposição de calor radiante não deve exceder 20 s. As estimulações infravermelhas na mesma pata traseira devem ter pelo menos 3 a 5 minutos de intervalo.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise do padrão de marcha NOTA: As análises do padrão de marcha foram medidas por meio de um sistema de imagem (Tabela de Materiais) e o observador ficou cego para as injeções que os animais haviam recebido.<ol><li>Ajuste o comprimento do compartimento de caminhada usando os botões em ambas as extremidades do compartimento de caminhada para um comprimento adequado para ratos (por exemplo, 61 cm).</li>
		<li>Coloque um rato no compartimento de caminhada e treine ratos para fazer corridas ininterruptas por pelo menos 5 ciclos de passos a uma velocidade de 18 cm/s antes do experimento formal. NOTA: Quando um rato é colocado pela primeira vez no compartimento de caminhada, a velocidade pode ser ajustada para cerca de 20 cm / s e desligada ao correr em torno de 2 s. Em seguida, defina a velocidade para 18 cm/s. Bata suavemente na parte de trás do rato com a divisória, se o rato parar ou recuar durante a caminhada. Tente reduzir a velocidade gradualmente de 18 cm/s para 10 cm/s. Se o rato eventualmente não conseguir realizar o teste, é aceitável escolher outro rato para o teste.</li>
		<li>Aumente lentamente a velocidade da esteira até atingir a velocidade alvo (18 cm/s). Capture pelo menos 5 s de vídeo de movimento contínuo do rato com a câmera de vídeo digital de alta velocidade montada abaixo da correia transparente da esteira.</li>
		<li>Teste cada rato com pelo menos 5 minutos de intervalo para obter pelo menos três corridas ininterruptas.</li>
		<li>Desenhe uma "caixa delimitadora" para definir o limite da imagem de caminhada de animais no software de imagem e insira a velocidade de execução de cada vídeo. Selecione vídeos como um grupo e processe vídeos automaticamente pelo software. Após o processamento dos vídeos, o software produzirá várias planilhas para relatar índices de marcha, incluindo postura, balanço, frenagem, propulsão, cadência, sequência de passos, etc.</li>
		<li>Calcule a área total da pata (cm2), o comprimento médio da passada (cm) e o comprimento da passada unite. NOTA: A área total da pata é a média da área total de quatro patas de cada grupo de ratos e a área da pata é definida como a área máxima da pata em contato com a esteira durante a fase de postura do ciclo de passos. O comprimento da passada é a distância entre os contatos iniciais da mesma pata em uma passada completa. Comprimento unitário da passada = comprimento médio da passada (cm)/comprimento do corpo (cm).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análises histopatológicas e imuno-histoquímicas
<ol><li>Eutanasiar ratos por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 150 mg/kg (preparado em solução salina). Ressecar as articulações do joelho imediatamente para as análises histológicas.</li>
	<li>Fixe as articulações em formalina a 10% por 24 h, descalcifique com EDTA a 10% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 8 semanas e, em seguida, incorpore as articulações em parafina. CUIDADO: A formalina pode causar irritação nos olhos, pele e trato respiratório. Deve ser manuseado em um exaustor.</li>
	<li>Secção das juntas embutidas em parafina com um micrótomo de 3 mm de espessura e flutuar num banho-maria a 40 °C contendo água destilada.</li>
	<li>Transfira seções para lâminas de vidro. Seque as lâminas durante a noite e armazene as lâminas à temperatura ambiente (RT) para continuar a coloração seguinte.</li>
	<li>Coloque as lâminas em forno a 60 °C por 4 h para desparafinizar.</li>
	<li>Imergir as lâminas sucessivamente em xileno, xileno, 100% etanol, 100% etanol, 95% etanol, 80% etanol e 75% etanol por 5 min, respectivamente, no RT.</li>
	<li>Cortes de coloração com hematoxilina e eosina (H&E), safranina-O (SO) e hematoxilina azul de Alcian (ABH), bem como anticorpos contra colágeno tipo II de rato (Col2), colágeno tipo X (Col10) e metaloproteinase de matriz 13 (MMP13), conforme descrito nas etapas 3.8 a 3.12.</li>
	<li>Coloração H&E<ol><li>Enxaguar as lâminas com H2O deionizado por 3 min. Lâminas de coloração com hematoxilina por 3 a 5 min.</li>
		<li>Enxaguar as lâminas com H2O 3x deionizado, 1 min cada, até que não permaneça hematoxilina na superfície.</li>
		<li>Escorregas de coloração com eosina por 30 s. Em seguida, enxaguar as lâminas com H2O 3x deionizado, 1 min cada, até que não permaneça nenhuma eosina na superfície.</li>
		<li>Mergulhe slides em 0,1% de amônia por 10 a 20 s. Em seguida, enxaguar as lâminas com H2O 3x deionizado, 1 min cada.</li>
		<li>Mergulhe as lâminas sucessivamente em etanol a 95%, etanol a 100%, xileno, xileno e xileno por 1 min, respectivamente.</li>
		<li>Deslize as lâminas por resina neutra.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração SO<ol><li>Enxaguar as lâminas com H2O deionizado por 3 min. Lâminas de coloração com hematoxilina por 3 a 5 min.</li>
		<li>Diferencie rapidamente em 1% de álcool ácido (cerca de 3 s). Em seguida, enxaguar as lâminas com H2O 3x deionizado, 1 min cada, até que não permaneça hematoxilina na superfície.</li>
		<li>Lâminas de coloração com solução Fast Green (FCF) por 5 min. Em seguida, enxaguar as lâminas com H2O 3x deionizado, 1 min cada.</li>
		<li>Escorregas de coloração com SO por 1 a 2 min. Em seguida, enxaguar as lâminas com H2O 3x deionizado, 1 min cada.</li>
		<li>Enxaguar as lâminas com ácido acético a 1% por 1 a 2 min para remover o FCF residual. Enxaguar as lâminas com H2O deionizado por 1 min.</li>
		<li>Mergulhe as lâminas sucessivamente em etanol a 95%, etanol a 100%, xileno, xileno e xileno por 1 min, respectivamente.</li>
		<li>Deslize as lâminas por resina neutra.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração ABH<ol><li>Enxaguar as lâminas com H2O deionizado por 3 min. Mergulhe as lâminas em álcool ácido a 1% por 30 s e escorra brevemente em um papel toalha (não enxágue).</li>
		<li>Mergulhe slides em ABH por 1 h. Em seguida, enxaguar as lâminas com H2O 3x deionizado, 1 min cada, até que não permaneça ABH na superfície.</li>
		<li>Diferencie rapidamente em 1% de álcool ácido (cerca de 3 s). Enxaguar as lâminas com H2O 3x deionizado, 1 min cada.</li>
		<li>Mergulhe as lâminas em água de amônio a 0,5% por 15 s. Em seguida, enxaguar as lâminas com H2O 3x deionizado, 1 min cada.</li>
		<li>Mergulhe as lâminas em etanol a 95% por 1 min. Mergulhe as lâminas em solução de eosina/laranja G por 1,5 min.</li>
		<li>Mergulhe as lâminas sucessivamente em etanol a 95%, etanol a 100%, xileno, xileno e xileno por 1 min, respectivamente.</li>
		<li>Deslize as lâminas por resina neutra.</li>
	</ol></li>
	<li>Examinar todas as lâminas ao microscópio e classificar estatisticamente em uma escala de 0−13 por observação duplo-cega, de acordo com o sistema de pontuação de Mankin14.</li>
	<li>Imuno-histoquímica<ol><li>Enxaguar as lâminas com H2O deionizado por 3 min.</li>
		<li>Imergir as lâminas em citrato de sódio 0,1 M e colocar as lâminas num forno a 60 °C durante 4 h para obter o antigénio.</li>
		<li>Mergulhe slides em Triton X-100 a 0,3% em PBS por 10 min. Em seguida, enxaguar as lâminas com PBS 2x, 3 min cada.</li>
		<li>Incubar seções em solução de H 2 O2a 3% em metanol em RT por 10 min para bloqueara atividade da peroxidase endógena. Enxaguar as lâminas com PBS 2x, 3 min cada.</li>
		<li>Incubar seções com soro de cabra a 5% em PBS por 30 min no RT para bloquear qualquer ligação não específica. Enxaguar as lâminas com PBS 2x, 3 min cada.</li>
		<li>Incubar cortes durante a noite a 4 °C com 100 μL de anticorpos primários diluídos em PBS (1:1.000) contra colágeno tipo II (Col2), colágeno tipo X (Col10) e metaloproteinase de matriz 13 (MMP13). Enxaguar as lâminas com PBS 2x, 3 min cada.</li>
		<li>Incubar seções com 100 μL de anticorpo secundário diluído em PBS (1:1.000) (cabra anti-camundongo secundário ou cabra anti-camundongo secundário) por 20 min no RT. Enxaguar lâminas com PBS 2x, 3 min cada.</li>
		<li>Incubar secções com 100 μL de solução de trabalho de 3,3′-diaminobenzidina (DAB). Monitore a reação à medida que a reação cromogênica torna os locais do epítopo marrons. CUIDADO: DAB é um carcinógeno. Sempre use luvas e trabalhe em um exaustor ao trabalhar com DAB. NOTA: O tempo de desenvolvimento de cores pode variar de alguns segundos a 10 minutos.</li>
		<li>Assim que uma cor marrom se desenvolver nas seções, enxágue as lâminas com H 2 O2xdeionizado, 3 min cada.</li>
		<li>Mergulhe as lâminas em hematoxilina por 1 a 2 minutos para contra-manchar as lâminas. Em seguida, enxaguar as lâminas com H2O 3x deionizado, 1 min cada.</li>
		<li>Mergulhe as lâminas sucessivamente em etanol a 95%, etanol a 100%, xileno, xileno e xileno por 1 min, respectivamente.</li>
		<li>Deslize as lâminas por resina neutra.</li>
		<li>Observe a cor da coloração do anticorpo nas seções sob um microscópio.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Hunter, D. J., Schofield, D., Callander, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+individual+and+socioeconomic+impact+of+osteoarthritis.">The individual and socioeconomic impact of osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 437-441 (2014).</li><li>Neogi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+and+impact+of+pain+in+osteoarthritis.">The epidemiology and impact of pain in osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 21 (9), 1145-1153 (2013).</li><li>Teeple, E., Jay, G. D., Elsaid, K. A., Fleming, B. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+evidence+that+the+vasoactive+intestinal+peptide+receptor+antagonist+VIP6-28+reduces+nociception+in+an+animal+model+of+osteoarthritis.">Electrophysiological evidence that the vasoactive intestinal peptide receptor antagonist VIP6-28 reduces nociception in an animal model of osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 14 (11), 1155-1162 (2006).</li><li>Lee, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choline,+an+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+agonist,+alleviates+hyperalgesia+in+a+rat+osteoarthritis+model.">Choline, an alpha7 nicotinic acetylcholine receptor agonist, alleviates hyperalgesia in a rat osteoarthritis model.</a> Neuroscience Letters. 548, 291-295 (2013).</li><li>Piesla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+gait,+due+to+inflammation+but+not+nerve+injury,+reflects+enhanced+nociception+in+preclinical+pain+models.">Abnormal gait, due to inflammation but not nerve injury, reflects enhanced nociception in preclinical pain models.</a> Brain Research. 1295, 89-98 (2009).</li><li>Udo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoiodoacetic+acid+induces+arthritis+and+synovitis+in+rats+in+a+dose-+and+time-dependent+manner:+proposed+model-specific+scoring+systems.">Monoiodoacetic acid induces arthritis and synovitis in rats in a dose- and time-dependent manner: proposed model-specific scoring systems.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1284-1291 (2016).</li><li>Guingamp, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mono-iodoacetate-induced+experimental+osteoarthritis:+a+dose-response+study+of+loss+of+mobility,+morphology,+and+biochemistry.">Mono-iodoacetate-induced experimental osteoarthritis: a dose-response study of loss of mobility, morphology, and biochemistry.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 40 (9), 1670-1679 (1997).</li><li>Jeong, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eupatilin+Exerts+Antinociceptive+and+Chondroprotective+Properties+in+a+Rat+Model+of+Osteoarthritis+by+Downregulating+Oxidative+Damage+and+Catabolic+Activity+in+Chondrocytes.">Eupatilin Exerts Antinociceptive and Chondroprotective Properties in a Rat Model of Osteoarthritis by Downregulating Oxidative Damage and Catabolic Activity in Chondrocytes.</a> PLoS ONE. 10 (6), 0130882 (2015).</li><li>Cook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+cartilage+repair.">Animal models of cartilage repair.</a> Bone &amp; Joint Research. 3 (4), 89-94 (2014).</li><li>Little, C. B., Zaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+constitutes+an+"animal+model+of+osteoarthritis"--the+need+for+consensus.">What constitutes an "animal model of osteoarthritis"--the need for consensus.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 20 (4), 261-267 (2012).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O modelo de OA de rato induzido por MIA é um modelo bem estabelecido e amplamente utilizado. A injeção intra-articular de AIM causa inicialmente inflamação grave e aguda, o que dá origem à fase mais longa e degenerativa da OA17,18. Nesta pesquisa, medimos a sensibilidade nociceptiva por TCM e TWL e avaliamos as alterações da marcha com um sistema de imagem. Relatos prévios constataram que a injeção de AIM poderia elevar a sensibilidade das fibras arti...

A osteoartrite (OA) é a doença articular mais comum no mundo, afetando cerca de 10-12% da população em adultos1. A articulação mais geralmente envolvida é o joelho, e a OA tem maior incidência em idosos, especialmente mulheres2. Como doença crônica, a OA desenvolve-se progressivamente ao longo de décadas em falência articular com sintomas como perda de cartilagem, inflamação sinovial, osteofitose, diminuição da função e dor crônica3. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), a OA é a quarta doença mais prevalente no sexo feminino e a oitava doença mais prevalente no sexo masculino. Até 2020, a OA pode se tornar a quarta doença mais incapacitante em humanos4. No entanto, as terapias atualmente disponíveis de OA abordam apenas os sintomas e estendem o tempo até a cirurgia de substituição articular5.
A OA espontânea em pacientes humanos muitas vezes leva muito tempo para produzir sintomas clínicos, como dor relacionada às articulações6. Nos estágios iniciais da OA, a dor geralmente é intermitente e torna-se mais frequente e grave à medida que a doença progride, tornando-se a queixa predominante dos pacientes7. Portanto, extensos modelos animais para a dor da OA foram desenvolvidos ao longo do último meio século para promover a terapia de alívio da dor. Os modelos de OA foram classicamente divididos em modelos espontâneos e induzidos. Os modelos espontâneos incluem modelos naturais e modelos geneticamente modificados, que podem simular mais de perto o curso da OA primária em humanos8. Os modelos induzidos geralmente podem ser divididos em duas categorias: 1) OA pós-traumática induzida por cirurgia ou outro trauma; ou 2) injeção intra-articular de substâncias condrotóxicas ou pró-inflamatórias3. Esses modelos estabelecem uma base para o estudo fisiopatológico da OA e contribuem muito para o desenvolvimento de drogas para reduzir a dor e aumentar a função.
Recentemente, o indutor mais utilizado para a modelagem da OA é o mono-iodoacetato (MIA). A AIM, inibidora da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, pode causar alterações na matriz cartilaginosa, degradação, perda de cartilagem, sinovite e outras alterações, que são semelhantes às alterações patológicas da osteoartrite humana9. Observou-se que a injeção intra-articular de AIM induziu dor contínua aos 28 dias após a administração da AIM, indicando que o modelo de AIM pode ser útil para investigar a dor nociceptiva crônica10,11,12. Neste estudo, ratos machos de Sprague-Dawley receberam injeções intra-articulares com 0,5, 1,5 ou 3 mg de MIA nas articulações do joelho. A gravidade da dor articular induzida por MIA foi medida pela avaliação da sensibilidade mecânica e térmica aos 1, 7, 14, 21, 28 e 35 dias após as injeções. Com base nisso, 1,5 mg de AIM foi selecionado como concentração final para avaliar os padrões de marcha e as alterações histológicas aos 28 dias após as injeções.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="781">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Anti-Collagen II antibody</td>
			<td style="width:255px;">Abcam(UK)</td>
			<td style="width:115px;">34712</td>
			<td style="width:191px;">Primary antibody for immunohistochemistry (IHC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Anti-Collagen X (Col10) antibody</td>
			<td style="width:255px;">Abcam(UK)</td>
			<td style="width:115px;">49945</td>
			<td style="width:191px;">Primary antibody for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">DigiGait Imaging System</td>
			<td style="width:255px;">Mouse Specifics (Boston, MA, USA)</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:191px;">Equipment for gait patterns analyses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Eosin</td>
			<td style="width:255px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">861006</td>
			<td style="width:191px;">The dye for HE staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:255px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">F7252</td>
			<td style="width:191px;">The dye for SO staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Goat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:255px;">ZSGQ-BIO (Beijing, China)</td>
			<td style="width:115px;">PV-9002</td>
			<td style="width:191px;">Secondary antibody for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Goat anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:255px;">ZSGQ-BIO (Beijing, China)</td>
			<td style="width:115px;">PV-9001</td>
			<td style="width:191px;">Secondary antibody for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:255px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">H3163</td>
			<td style="width:191px;">The dye for HE staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">MIA</td>
			<td style="width:255px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">I4386-10G</td>
			<td style="width:191px;">powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">MMP13</td>
			<td style="width:255px;">Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)</td>
			<td style="width:115px;">69926</td>
			<td style="width:191px;">Primary antibody for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Modular tissue embedding center</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher Scientific (USA)</td>
			<td style="width:115px;">EC 350</td>
			<td style="width:191px;">Produce paraffin blocks.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Plantar Test apparatus</td>
			<td style="width:255px;">UgoBasile (Italy)</td>
			<td style="width:115px;">37370</td>
			<td style="width:191px;">Equipment for TWL assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)</td>
			<td style="width:255px;">TaKaRa Biotechnology Co. Ltd. (Dalian, China)</td>
			<td style="width:115px;">RR037A</td>
			<td style="width:191px;">Extracte total RNA from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Rotary and Sliding Microtomes</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher Scientific (USA)</td>
			<td style="width:115px;">HM325</td>
			<td style="width:191px;">Precise paraffin sections.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Safranin-O</td>
			<td style="width:255px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">S2255</td>
			<td style="width:191px;">The dye for SO staining</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tissue-Tek VIP 5 Jr</td>
			<td style="width:255px;">Sakura (Japan)</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:191px;">Vacuum Infiltration Processor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

osteoarthritis pain model induced by intra-articular injection of mono-iodoacetate in rats

Os modelos animais atuais de osteoartrite (OA) podem ser divididos em modelos espontâneos e modelos induzidos, ambos com o objetivo de simular as alterações fisiopatológicas da OA humana. No entanto, como principal sintoma na fase tardia da OA, a dor afeta a vida diária dos pacientes, não havendo muitos modelos disponíveis. O modelo induzido por monoiodoacetato (MIA) é o modelo de dor de OA mais utilizado, utilizado principalmente em roedores. A AIM é um inibidor da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, que causa morte por condrócitos, degeneração da cartilagem, osteófito e alterações mensuráveis no comportamento animal. Além disso, alterações de expressão da metaloproteinase da matriz (MMP) e citocinas pró-inflamatórias (IL1 β e TNF α) podem ser detectadas no modelo induzido por MIA. Essas alterações são consistentes com as condições fisiopatológicas da OA em humanos, indicando que a AIM pode induzir um modelo de dor da OA mensurável e bem-sucedido. Este estudo tem como objetivo descrever a metodologia de injeção intra-articular de MIA em ratos e discutir os comportamentos relacionados à dor resultantes e as alterações histopatológicas.

Com essa metodologia, estabelecemos um modelo de dor da OA no rato e detectamos as alterações resultantes. O TCM e a TWL refletiram alodinia mecânica e hiperalgesia térmica, respectivamente. Como mostra a Figura 1, a AIM induziu alodinia mecânica e hiperalgesia térmica presentes de forma dose-dependente. Notavelmente, a diminuição do TCM atingiu um pico de 21 dias para 28 dias, e depois se recuperou, sugerindo que o reparo articular pode ocorrer nesta fase, mas o TCM do grupo MIA de ...

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Osteoarthritis Pain Model Induced by Intra-Articular Injection of Mono-Iodoacetate in Rats

Este estudo descreve o método de injeção intra-articular de mono-iodoacetato em ratos e discute os comportamentos relacionados à dor resultantes e as alterações histopatológicas, que fornecem referências para futuras aplicações.

Modelo de Dor da Osteoartrite Induzida pela Injeção Intra-Articular de Mono-Iodoacetato em Ratos

The current animal models of osteoarthritis (OA) can be divided into spontaneous models and induced models, both of which aim to simulate the ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

7.9K visualizações.  Zhejiang Chinese Medical University. Este estudo descreve o método de injeção intra-articular de mono-iodoacetato em ratos e discute os comportamentos relacionados à dor resultantes e as alterações histopatológicas, que fornecem referências para futuras aplicações.

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Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present here a protocol for elevating intraocular pressure (IOP) in the rat, by injecting magnetic microspheres into the anterior chamber of the eye. The use of magnetic particles allows the user to manipulate the beads into the iridocorneal angle, thus providing a very effective blockade of fluid outflow from the trabecular meshwork. This leads to long-lasting IOP rises, and eventually neuronal death in the ganglion cell layer (GCL) as well as optic nerve pathology, as seen in patients with the disease. This method is simple to perform, as it does not require machinery, specialist surgical skills, or many hours of practice to perfect. Furthermore, the pressure elevations are very robust, and reinjection of the magnetic microspheres is not usually required unlike in some other models using plastic beads. Additionally, we believe this method is suitable for adaptation for the mouse eye.

We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

Experimental Glaucoma induzida pela injeção de microesferas magnéticas Ocular

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present ...

Medicina

The Monoiodoacetate Model of Osteoarthritis Pain in the Mouse

A major symptom of patients with osteoarthritis (OA) is pain that&#160;is triggered by peripheral as well as central changes within the pain pathways. The current treatments for OA pain such as NSAIDS or opiates are neither sufficiently effective nor devoid of detrimental side effects. Animal models of OA are being developed to improve our understanding of OA-related pain mechanisms and define novel pharmacological targets for therapy. Currently available models of OA in rodents include surgical and chemical interventions into one knee joint. The monoiodoacetate (MIA) model has become a standard for modelling joint disruption in OA in both rats and mice. The model, which is easier to perform in the rat, involves injection of MIA into a knee joint that induces rapid pain-like responses in the ipsilateral limb, the level of which can be controlled by injection of different doses. Intra-articular injection of MIA disrupts chondrocyte glycolysis by inhibiting glyceraldehyde-3-phosphatase dehydrogenase and results in chondrocyte death, neovascularization, subchondral bone necrosis and collapse, as well as inflammation. The morphological changes of the articular cartilage and bone disruption are reflective of some aspects of patient pathology. Along with joint damage, MIA injection induces referred mechanical sensitivity in the ipsilateral hind paw and weight bearing deficits that are measurable and quantifiable. These behavioral changes resemble some of the symptoms reported by the patient population, thereby validating the MIA injection in the knee as a useful and relevant pre-clinical model of OA pain.
The aim of this article is to describe the methodology of intra-articular injections of MIA and the behavioral recordings of the associated development of hypersensitivity with a mind to highlight the necessary steps to give consistent and reliable recordings.

Osteoarthritis (OA), or degenerative joint disease, is a debilitating condition associated with pain that remains only partially controlled by available analgesics. Animal models are being developed to improve our understanding of OA-related pain mechanisms. Here we describe the methodology for the monoiodoacetate model of OA pain in the mouse.

O Modelo Monoiodoacetate da osteoartrite Dor no mouse

A major symptom of patients with osteoarthritis (OA) is pain that&#160;is triggered by peripheral as well as central changes within the pain pathways. The ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

Um modelo de Glaucoma induzido por sutura Circumlimbal em ratos e camundongos

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in addition to a clinical, functional assessment methodology, including details for further encouragement of the development of non-drug surgical intervention strategies in knee osteoarthritis patients. However, we only present the effect of LBPP training in improvement of pain and knee function in one patient through three-dimensional gait analysis. The exact, long-term effects of this approach should be explored in future studies.

Here, based on a clinician&#8217;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in addition to a clinical, functional assessment methodology, including details for further encouragement of the development of non-drug surgical intervention strategies in knee osteoarthritis patients. However, we only present the effect of LBPP training in improvement of pain and knee function in one patient through three-dimensional gait analysis. The exact, long-term effects of this approach should be explored in future studies.

A esteira de pressão positiva do corpo inferior para a reabilitação da osteoartrite do joelho

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely correlated with a history of articular cartilage damage and ligament avulsion. Surgical animal models of OA of the knee play an important role in understanding the onset and progression of post-traumatic OA and aid in the development of novel therapies for this disease. However, non-surgical models have been recently considered to avoid traumatic inflammation that could affect the evaluation of the intervention. 
In this study, an intra-articular cartilage lesion rat model induced by in vivo cyclic compressive loading was developed, which allowed researchers to (1) determine the optimal magnitude, speed, and duration of load that could cause focal cartilage damage; (2) assess post-traumatic spatiotemporal pathological changes in chondrocyte vitality; and (3) evaluate the histological expression of destructive or protective molecules that are involved in the adaptation and repair mechanisms against joint compressive loads. This report describes the experimental protocol for this novel cartilage lesion in a rat model.

Here, we present the cyclic loading-induced intra-articular cartilage lesion model of the rat knee, generated by 60 cyclic compressions over 20 N, resulting in damage to the femoral condylar cartilage in rats.

Um Método Não Invasivo para Gerar o Modelo de Lesão da Cartilagem Intra-Articular Induzida por Carga Cíclica do Joelho de Rato

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...

Protocol for Developing a Femur Osteotomy Model in Wistar Albino Rats

Fracture healing is a physiological process resulting in the regeneration of bone defects by the coordinated action of osteoblasts and osteoclasts. Osteoanabolic drugs have the potential to augment the repair of fractures but have constraints like high costs or undesirable side effects. The bone healing potential of a drug can initially be determined by in vitro studies, but in vivo studies are needed for the final proof of concept. Our objective was to develop a femur osteotomy rodent model that could help researchers understand the development of callus formation following fracture of the shaft of the femur and that could help establish whether a potential drug has bone healing properties. Adult male Wistar albino rats were used after Institutional Animal Ethics Committee clearance. The rodents were anesthetized, and under aseptic conditions, complete transverse fractures at the middle one-third of the shafts of the femurs were created using open osteotomy. The fractures were reduced and internally fixed using intramedullary K-wires, and secondary fracture healing was allowed to take place. After surgery, intraperitoneal analgesics and antibiotics were given for 5 days. Sequential weekly x-rays assessed callus formation. The rats were sacrificed based on radiologically pre-determined time points, and the development of the fracture callus was analyzed radiologically and using immunohistochemistry.

Here, we present a protocol to iatrogenically fracture the shaft of the femur of Wistar albino rats and follow up on the development of the callus. This femur osteotomy model can help researchers evaluate the process of fracture healing and to study how a drug could influence fracture healing.

Protocolo para o Desenvolvimento de um Modelo de Osteotomia do Fêmur em Ratos Albinos Wistar

Fracture healing is a physiological process resulting in the regeneration of bone defects by the coordinated action of osteoblasts and osteoclasts. ...

Terapia FSN para controle da dor da osteoartrite do joelho

Fu's Subcutaneous Needling for Knee Osteoarthritis Pain

Fu's subcutaneous needling (FSN) is a new acupuncture and dry needling technique based on traditional Chinese medicine. It rapidly produces long-lasting effects in soft tissue injuries, particularly in painful musculoskeletal conditions, by providing stimulation primarily in the subcutaneous area. Osteoarthritis (OA) is the most common joint disease in adults worldwide and is often accompanied by a painful syndrome of structural changes in the peripheral joints of the knee. However, the etiology of OA pain is not fully understood, though myofascial trigger points (MTrPs) are commonly found in the lower limb muscles (so-called "tightened muscles") of patients with knee OA. 
FSN has been used in many fields for the treatment of acute pain problems and can relieve muscle contraction from MTrPs, thereby improving the local circulation. This study recruited patients with pain from knee OA into an FSN group or a transcutaneous electrical nerve stimulation (TENS) group with three treatment sessions and a follow-up over the course of 2 weeks. The results showed that FSN was effective in treating soft tissue pain around the knee with OA. This study aimed to establish and visualize three key technical indicators during FSN therapy, including the FSN needle insertion point and layer; the frequency and duration of the swaying movement; and the manipulation of the reperfusion approach. These findings have great potential for future applications in myofascial pain treatment, especially for pain management. Following this protocol could enhance FSN skills.

Autor em destaque: Agulhamento subcutâneo de Fu para dor de osteoartrite no joelho  

We present a protocol for using Fu's subcutaneous needling for knee osteoarthritis pain, which combines swaying movement and reperfusion approach techniques. This protocol has great potential for future applications in myofascial pain treatment and could enhance Fu's subcutaneous needling (FSN) manipulation skills.

Agulhamento Subcutâneo de Fu para Dor de Osteoartrite de Joelho

Fu's subcutaneous needling (FSN) is a new acupuncture and dry needling technique based on traditional Chinese medicine. It rapidly produces long-lasting ...

Manipulação padronizada de Tuina para osteoartrite do joelho em ratos

Tuina Manipulation to Reduce Inflammation and Cartilage Loss in Knee Osteoarthritis Rats

Clinical trials suggest that Tuina manipulation is effective in treating knee osteoarthritis (KOA), while further studies are required to discover its mechanism. Therefore, the manipulation of animal models of knee osteoarthritis is critical. This protocol provides a standard process for Tuina manipulation on KOA rats and a preliminary exploration of the mechanism of Tuina for KOA. The press and kneading manipulation method (a kind of Tuina manipulation that refers to pressing and kneading the specific area of the body surface) is applied on 5 acupoints around the knee joint of rats. The force and frequency of the manipulation were standardized by finger pressure recordings, and the position of the rat during manipulation is described in detail in the protocol. The effect of manipulation can be measured by pain behavior tests and microscopic findings in synovial and cartilage. KOA rats showed significant improvement in pain behavior. The synovial tissue inflammatory infiltration was reduced in the Tuina group, and the expression of tumor necrosis factor (TNF)-&#945; was significantly lower. Compared to the control group, chondrocyte apoptosis was less in the Tuina group. This study provides a standardized protocol for Tuina manipulation on KOA rats and preliminary proof that the therapeutic effects of Tuina may be related to reducing synovial inflammation and delayed chondrocyte apoptosis.

Autor em destaque: Compreendendo o mecanismo de manipulação da tuina em ratos 

We present a protocol for Tuina manipulation performed on plaster-immobilized-induced knee osteoarthritis rats. Based on the preliminary results, it suggested that the efficacy of the method relied on the reduction of inflammation and cartilage loss.

Manipulação de Tuina para Reduzir a Inflamação e Perda de Cartilagem em Ratos com Osteoartrite de Joelho

Clinical trials suggest that Tuina manipulation is effective in treating knee osteoarthritis (KOA), while further studies are required to discover its ...