We thank Kwon laboratory members for helpful discussions. This work was supported by grants from NHLBI/NIH (R01HL111198) and Maryland Stem Cell Research Fund (MSCRF).

Alle Mäuse wurden an einer amerikanischen Vereinigung für die Akkreditierung von Laboratory Animal Care (AAALAC) gehalten -accredited Tierhaltung an der Johns Hopkins University und in Übereinstimmung mit den im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren beschriebenen Verfahren untergebracht. Das Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) stimmten allen Versuchsprotokolle. 1. Versuchsvorbereitung <ol><li> Mantel 12-Well-Platte mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) in Phosphat-gepufferter Lösung (PBS) für 60 min. </li><li> Entfernen Beschichtungslösung und mit 200 &amp; mgr; l serumfreien Medien (SFM). Wirbeln Platte, um sicherzustellen, dass ein Film von Medien deckt die gesamte Fläche. </li></ol> 2. Chirurgische Verfahren <ol><li> Euthanize schwangeren Mäusen mit Tierpflegeausschuss genehmigten Protokoll der Institution durch Genickbruch folgte, um eine vollständige Euthanasie zu gewährleisten. </li><li> Spray und reinigen Sie die Bauchregion des Maus mit 70%Ethanol. Strikte sterile Techniken, um Verunreinigungen zu vermeiden. </li><li> Verwenden einer Pinzette und Schere, ein 0,5 cm 2 Schnitt am Nabel Region zu machen. </li><li> Benutzen Sie die Finger zu klemmen / greifen die Haut über und unter dem Einschnitt und ziehen Sie die Haut in entgegengesetzte Richtungen (Kopf und Schwanz). </li><li> Verwenden einer Pinzette und Schere, um eine anfängliche Einschnitt in der Membran an der Nabelregion zu machen. Schneiden Sie vorsichtig die Membran in V-Form vom Nabel bis der Eierstöcke auf jeder Seite (2 x 1,5 cm 2), wodurch die Gebärmutter enthüllt. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um die Eileiter Anschluss der Gebärmutter auf die Eierstöcke und Scheren kneifen, um die Eileiter auf dem Eierstock Seite kneifen, so befreien die Gebärmutter aus dem Eierstock. </li><li> Ziehen Sie vorsichtig die Gebärmutter durch die Eileiter mit der Pinzette und schneiden die Gebärmutter kostenlos von der Blase Region mit einer Schere. </li><li> Ziehen die Gebärmutter weiter durch den Eileiter mit der Zange, und schneiden den Eileiter mit einer Schere an der anderen Seite, wodurch der Uterus Freigabe von der mOuse. </li><li> Übertragen Sie die Gebärmutter auf eine 50-ml-Röhrchen und fügen Sie 20 ml kaltem sterilem PBS mit Ca 2+ und Mg 2+. PBS muss Ca 2+ und Mg 2+ bei Embryo Dissektion enthalten. </li><li> Schütteln Sie das Röhrchen für 10 Sekunden, um die Gebärmutter für die Blutwäsche. </li><li> Übertragen Sie die Gebärmutter aus dem Rohr mit einer Pinzette und legen Sie sie in einem 10 ml Schale und mit 5 ml kaltem PBS auf der Oberseite der Gebärmutter. </li><li> Die Schale mit der Gebärmutter unter einem Stereomikroskop. Hinweis: Die Schritte 2,13-2,19 erfordert ein Stereomikroskop. </li><li> Verwenden Sie zwei Paar Pinzette vorsichtig öffnen Sie die Gebärmutter und sezieren Fruchtblasen mit Embryonen aus der Gebärmutter einer nach dem anderen. <ol><li> Verwenden Sie zwei Paar Pinzette vorsichtig öffnen Sie die Fruchtblase, die den Embryo umgibt, kneifen den Sack mit einer Pinzette und entfernen Sie sie aus dem Embryo, verwenden Sie die andere Zange zu schneiden und lassen Sie die Fruchtblase aus dem Embryo. Wenn ein bestimmter Genotyp erforderlich, halten Fruchtblase für die Genotypisierung. </li></ol></li><li> Setzen Sie den Embryo auf der Seite und Verwenden einer Pinzette, um die 1 und 2. nach hinten wölben zum Herzen zwischen dem Bogen und dem Schlundtasche (1A &#39;&#39;) geschnitten. </li><li> Flip sanft den Embryo auf die andere Seite und verwenden Sie Zange um den 1. und 2. Bogen nach hinten, um das Herz zwischen dem Bogen und dem Schlundtasche abgeschnitten. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um die Herzausflusstrakt, die immer noch den Anschluss wird die 1. und 2. Schlundbögen für den Embryo zu schneiden. Entfernen der Bögen, die sich noch in der Form eines Schmetterlings (1B) miteinander verbunden sind, aus dem Embryo. </li><li> Verwenden einer Pinzette zu kneifen und lassen Sie die 1. Schlundbögen von der übrigen Herzausflusstrakt und Vorderdarm Endoderm (1B &#39;&#39; mit gestrichelten Linie angedeutet und *). </li><li> Verwenden einer Pinzette zu kneifen und lassen Sie die 2. Schlundbögen von der übrigen Herzausflusstraktund Vorderdarm Endoderm (1B &#39;&#39; mit gestrichelten Linie und ** angegeben). </li><li> Übertragen jedes Paar von Bögen einzeln mit einer Pinzette und legen Sie beide Bögen in der Mitte des ein gut bezeichnet. Platte 1 und 2. Schlundbögen in getrennten Vertiefungen. Sicherzustellen, daß die Bögen in Kontakt mit dem Film von Medien in Schritt 1.2 gegeben. Entscheidend ist, dass Bögen NICHT von Medium bedeckt, wie sie benötigen, um den Kontakt mit der Oberfläche der Bohrung zur Befestigung in dieser Periode zu machen. </li></ol> 3. Inkubation und Imaging <ol><li> Bogen in der Platte mit 12 Vertiefungen plattiert Inkubieren in 37 ° C / 5% CO 2 für 2 Stunden für Bögen zum Brunnen Oberfläche zu befestigen. </li><li> Vorsichtig mit 200 &amp; mgr; l von 37 ° C SFM an der Seite des Bohrlochs. Stellen Sie sicher, dass Bögen befestigt bleiben und Inkubation O / N. </li><li> Am nächsten Tag, visuell zu überprüfen, dass Schlundbögen befestigt und sanft mit 200 &amp; mgr; l von 37 ° C SFM an der Seite dergut. Wenn Bögen bleiben ungebunden und schwimm, entfernen Medien mit einer Pipette, ohne Bögen, bis nur noch ein Film von Medien überlassen. Verwenden Pipettenspitze auf Bögen in der Mitte der gut und wiederholen Sie Schritt 3.1 zu platzieren. </li><li> Überwachen Sie täglich; fügen ~ 100-200 ul Medium jeden 2. Tag jeder verdampft Medien zu ersetzen. Hinweis: 24-48 h nach der wandernden Zellen erscheinen rund um den Bogen und sich vermehren und wandern von Bogen in den nächsten 5-8 Tage. Nach 36-72 h Bildung schlagen Kardiomyozyten können aus der 2. Schlundbogen (2B) beobachtet werden. Myotube Bildung können vom 1. Schlundbogen 3-7 Tage nach der Befestigung (2A) zu beachten. </li></ol>

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	<li>Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+heart+field.">The second heart field.</a> Curr Top Dev Biol. 100, 33-65 (2012).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease.">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li><li>Tzahor, E., Evans, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharyngeal+mesoderm+development+during+embryogenesis:+implications+for+both+heart+and+head+myogenesis.">Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis.</a> Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Contact+with+Endoderm-like+Cells+Efficiently+Induces+Cardiac+Progenitors+from+Mouse+and+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells.</a> PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140, 2587-2596 (2013).</li><li>Kwon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+pathway+involving+Notch1/beta-catenin/Isl1+determines+cardiac+progenitor+cell+fate.">A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate.</a> Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, e02164 (2014).</li><li>Grevellec, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharyngeal+pouches+and+clefts:+Development,+evolution,+structure+and+derivatives.">The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives.</a> Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).</li><li>Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+acts+at+multiple+developmental+stages+to+promote+mammalian+cardiogenesis.">Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis.</a> Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).</li><li>Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+for+the+heart:+perspectives+on+stem-cell+therapy.">Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy.</a> Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In diesem Video zeigen wir, wie man isolieren und Kultur ersten und zweiten Schlundbögen von 9,5 Tage alten Mausembryos. Schlundbögen sind vergänglich, segmentiert Ausbuchtungen, die auf der Seite des kraniolateral entwickelnden Embryonen 9, die multi-potenten Herzvorläuferzellen-Bausteine ​​enthalten, um das Herz während der Embryogenese 10,11 -in zweiten Bögen und Kopfmuskelvorläuferzellen in der ersten Bögen 8 erscheinen . Dissektion der Schlundbögen erfordert erweiterte Maus-Embryo Dissektion Fähigkeiten. Sobald Bögen wurden erfolgreich mit diesen schrittweise Protokoll präpariert und übertragen, um vorab beschichteten Vertiefungen, ist es entscheidend, dass Bögen anzubringen, um den Bodenbereich. In diesem Protokoll beschichten wir Wells mit 10% FBS, gefolgt von Kultur in SFM was Anhaftung und das Wachstum von&gt; 75% der Bögen, wobei jedoch auch andere Beschichtungsmaterialien verwendet werden (Matrigel, Gelatine, Fibronektin etc.) sowie Serum containing Medien. Die Schlundbögen dient als primordia für eine Vielzahl von Strukturen während der Entwicklung. Nach der Grundausbildung der Schlundbögen (8 Tage nach der Befruchtung in Mäusen), CPCs zu erweitern in der PA2 und wandern in das Herzausflusstrakt, wo sie differenzieren sich in Herzzellen und damit als erneuerbare Quelle von CPCs, die Zellen benötigt, um Herz aufrechtzuerhalten liefert dien Wachstum. Da die Schlundbögen sind zeitliche Entwicklungsstrukturen (E8-11.5) und die Migration von CPCs in den Ausflusstrakt erfolgt ab ca. E8-E10) das bringt gewisse Beschränkungen an die Technik. Für CPC Studien empfehlen wir Schlundbögen zwischen E9-10 seziert, in dieser Phase jede PA2 enthalten etwa 5 bis 800 RFP + Zellen (Mesp1 linage trace). Mit Fluoreszenzmarkierung, können wir diese ex vivo Kultur zu entwickeln Vorläuferzellen und deren Differenzierung in Herzmuskelzellen zu schlagen oder Myotuben i überwachenn Echtzeit. Darüber hinaus kann dieser ex vivo-Kultursystem verwendet werden, um Rollen von zell autonomer Mikroumgebungsfaktoren Herz / Muskelvorläuferzellproliferation, Migration und Differenzierung unter Verwendung von existierenden Cre / loxP Linien beeinflussen untersuchen. Als solches ist dieses System erwartet, dass Herz / Muskelvorläufernische Studien, die zu einem besseren Verständnis des Herzens / Muskelbildung und Krankheit führen können, zu erleichtern.

Rachen Mesodermzellen Anlass zu Teilen des Herzens und der Rachenmuskeln. Während der embryonalen Entwicklung, multiHerzVorläuferZellen aus dem zweiten Herzfeld wandern aus dem Rachen Mesoderm und bevölkern die Herzausflusstrakt und rechten Herzkammer und ihre abnorme Entwicklung ist eng mit angeborenem Herzfehler-die häufigste Ursache von Geburtsschäden und Geburtsdefekt zugeordnet bedingten Todesfälle beim Menschen 1-3. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Rachen-Mesoderm trägt zur Muskulatur Kopf, zusätzlich zu Herzen, was die Mesoderm ein kritischer Teil der Herz-Kreislauf-kraniofazialen Entwicklung 4. So sind die Entwicklungsprozesse einschließlich Induktion, Proliferation und Differenzierung von Kopf und Herz-Vorläufern in der Rachen Mesoderm aktiv untersucht 5-7. Bis vor kurzem blieb es unbekannt, ob Herzvorläuferzellen Expansion witho unterziehenut Differenzierung, was teilweise auf das Fehlen von Informationen über ihre zellulären Umgebung. Unsere aktuelle Studie legt nahe, dass Schlundbögen dienen als Mikroumgebung für die Erneuerung der Herz- und Muskelvorläuferzellen und kann über mehrere Wochen 8 ex vivo kultiviert werden. Das Explantat Verfahren bietet eine neue und einzigartige Möglichkeit, die Entwicklung von Herz-Kreislauf-kraniofaziale Vorläuferzellen ex vivo zu studieren.

<table><tbody><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>PBS + Ca&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; + Mg&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri plates</td><td>Fishersci</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Scissor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serum Free Media:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Cellgro</td><td>15-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ham&amp;rsquo;s F12</td><td>Cellgro</td><td>10-080-CV</td><td></td></tr><tr><td>N2-SUPPLEMENT</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27-retinoic acid</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>10% BSA (in PBS) (Invitrogen Cat#. P2489)</td><td>Life Sciences</td><td>P2489</td><td></td></tr><tr><td>100x Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081)</td><td>Gibco</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>100x Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo culture of pharyngeal arches to study heart and muscle progenitors and their niche

Die Rachen Mesoderm der sich entwickelnden Embryonen trägt zur breiten Regionen von Kopf und Herzmuskulatur. Wir haben ein neues Verfahren, um Kopf und Herz-Vorläuferzellentwicklung mit Schlundbögen (auch als Kiemenbögen bekannt) ex vivo zu studieren entwickelt. Mit dieser Methode haben wir kürzlich beschrieben, dass die zweite Schlundbogen enthält selbst erneuernden Herzvorläuferzellen und dient als Mikroumgebung für die Expansion der Vorläuferzellen der Maus während der Herzentwicklung. Die Vorläuferzellen bleiben undifferenziert und expansive innerhalb des Bogens, aber schnell funktionelle Kardiomyozyten, als sie aus dem Bogen zu migrieren. Wir haben auch berichtet, dass erste Schlundbogen enthält Muskelvorläuferzellen, die zu Myotuben nach dem Verlassen des arch. Hier zeigen wir, das Verfahren für die Präparation und ex vivo Kultur der ersten und zweiten Schlundbögen aus Entwicklungs Maus-Embryonen. Das Verfahren ermöglicht es, Kopf und Herz-Vorläufer / Muskel dev studierenelopment, einschließlich Kardiomyozyten und Myotuben Bildung im Detail ex vivo.

Während der Entwicklung können Gesichtsmuskel und Herzvorläuferzellen zurückgeführt werden, wie sie sich vermehren und wandern aus dem 1. und 2. Schlundbogen, um Kopf und Herzmuskulatur, bzw. (1A, A &#39;und A&#39; &#39;) zu werden. Kultivieren Schlundbögen bietet eine einzigartige Möglichkeit, um Herz und Muskelentwicklung im Detail ex vivo zu studieren. Nach Präparation und Befestigung der Schlundbögen können von wandernden Zellen angebracht Bögen innerhalb von 24-48 Stunden der Kultur zu beobachten. Innerhalb von 3 Tagen Kultur Myotube Bildung kann vom 1. Schlundbögen und Herzmuskelbildung aus der 2. Schlundbögen (2A und 2B) beobachtet werden. Herzmuskelbildung kann visuell durch spontan kontra Cluster von wandernden Zellen und / oder Analyse der spezifischen Kardiomyozyten Marker bestätigt werden (zB Cardiac Troponin T). Myotuwerden / Gesichtsmuskelbildung kann visuell durch lange (bis zu 500 &amp; mgr; m in der Länge) spontan zu zucken Zellen und / oder Analyse der spezifischen Muskelmarkierungen (zB Myogenin) verlängert beachten. Durch die Verwendung des cre-lox-System bei Mäusen, Mesoderm Nachkommen kann durch fluoreszierende Reporter auf cre-Expression während der Ex-vivo-Kultur (2A &#39;und 2B&#39;) zurückgeführt werden. Ebenso ist es mit diesem Verfahren möglich, das Schicksal der Nachkommen zu untersuchen, bei dem eine bestimmte interessierende Gen bedingt ausgeschlagen oder überexprimiert wird, die sonst in der frühen embryonalen Letalität führen, wie wir zuvor beschriebenen 8. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52876/52876fig1.jpg" /> Abbildung 1: Maus-Embryo (Mesp1 cre, Ai9) 9,5 Tage nach der Befruchtung (E.9.5 </strong<html> &gt;). (A) Linke Seite des Embryos. (PA: Schlundbogen, OT: Ausflusstrakt, LV:.. Linke Herzkammer (A &#39;) Mesp1 linage-Spur; RFP markiert Mesp1 + Zellen und deren Nachkommen Pfeil zeigt RFP + Mesp1-Nachkommen in PA2, die kontinuierlich mit der OT ist. (A &#39;&#39;) Eine gestrichelte Linie anzuzeigen, wo PA1 und PA2 hinter der durchs Herz (B) Schmetterlings-like rechts und links PA1 und PA2 nach der Sektion aus dem Embryo FE:.. Vorderdarm Endoderm (B. &#39;) RFP Marken Mesp1 Nachkommen . in PA1 und PA2 (B &#39;&#39;) * und ** zusammen mit den gestrichelten Linien zeigt an, wo zu schneiden und zu lösen PA1 und PA2 von dem OT und FE Maßstabsbalken:.. 500 &amp; mgr; m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52876/52876fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Abbildung.</a> laden / 52.876 / 52876fig2.jpg &quot;/&gt; Abb. 2: Cultured Schlundbögen (A) Cultured PA1 (3 Tage der Kultur). (A &#39;) RFP markiert Mesp1 Nachkommen in PA1. Pfeile und * zeigen frühen Myotube Bildung. (A &#39;&#39;) Overlay von RFP Ausdruck in PA1. (B) kultivierte PA2 (8 Tagen Kultur). (B &#39;) RFP Marken Mesp1 Nachkommen in PA2. Pfeile und ** deuten schlagen Bereich der Herzmuskelzellen (von Shenje et al. 8 modifiziert). (B &#39;&#39;) Overlay von RFP Ausdruck in PA2. Maßstab:. 250 &amp; mgr; m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52876/52876fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Ex-vivo-Kultur von Schlundbögen auf Herz und Muskelvorläuferzellen und ihre Nische Studieren

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

ex-vivo-culture-pharyngeal-arches-to-study-heart-muscle-progenitors

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

7.8K Aufrufe.  Johns Hopkins University School of Medicine. Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Serie: Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-&#946;1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

In - vitro - Kultur von Epikardiale Zellen aus embryonalen Maus - Herz

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium ...

Ingenieurwesen

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Mikroinjektion basierenden System für In Vivo Implantation von embryonalen Kardiomyozyten des aviären Embryos

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in developmental cardiology have led to generating cardiac cells from pluripotent stem cells, it is unclear if the two cardiac fields - the first and second heart fields (FHF and SHF) &#8212; are induced in pluripotent stem cells systems. To address this, we generated a protocol for in vitro specification and isolation of heart field-specific cardiac progenitor cells. We used embryonic stem cells lines carrying Hcn4-GFP and Tbx1-Cre; Rosa-RFP reporters of the FHF and the SHF, respectively, and live cell immunostaining of the cell membrane protein Cxcr4, a SHF marker. With this approach, we generated progenitor cells which recapitulate the functional properties and transcriptome of their in vivo counterparts. Our protocol can be utilized to study early specification and segregation of the two heart fields and to generate chamber-specific cardiac cells for heart disease modelling. Since this is an in vitro organoid system, it may not provide precise anatomical information. However, this system overcomes the poor accessibility of gastrulation-stage embryos and can be upscaled for high-throughput screens.

The purpose of this method is to generate heart field-specific cardiac progenitor cells in vitro in order to study the progenitor cell specification and functional properties, and to generate chamber specific cardiac cells for heart disease modelling.

In Vitro-Generierung von Mausherzfeldspezifischen Herzvorläuferzellen

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart disease. To study the formation of PAAs, we developed a protocol using whole-mount immunofluorescence coupled with benzyl alcohol/benzyl benzoate (BABB) tissue clearing, and confocal microscopy. This allows for the visualization of the pharyngeal arch endothelium at a fine cellular resolution as well as the 3D connectivity of the vasculature. Using software, we have established a protocol to quantify the number of endothelial cells (ECs) in PAAs, as well as the number of ECs within the vascular plexus surrounding the PAAs within pharyngeal arches 3, 4, and 6. When applied to the whole embryo, this methodology provides a comprehensive visualization and quantitative analysis of embryonic vasculature.

Here, we describe a protocol to visualize and analyze the pharyngeal arch arteries 3, 4, and 6 of mouse embryos using whole-mount immunofluorescence, tissue clearing, confocal microscopy, and 3D reconstruction.

Visualisierung und Analyse von Pharyngeal Arch Arterien mittels ganzer Immunhistochemie und 3D-Rekonstruktion

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in vitro. Developing more efficient organ-like platforms that can model complex in vivo phenotypes, such as organoids and organs-on-a-chip, will enhance the ability to study human heart development and disease. This paper describes a protocol to generate highly complex human heart organoids (hHOs) by self-organization using human pluripotent stem cells and stepwise developmental pathway activation using small molecule inhibitors. Embryoid bodies (EBs) are generated in a 96-well plate with round-bottom, ultra-low attachment wells, facilitating suspension culture of individualized constructs.
The EBs undergo differentiation into hHOs by a three-step Wnt signaling modulation strategy, which involves an initial Wnt pathway activation to induce cardiac mesoderm fate, a second step of Wnt inhibition to create definitive cardiac lineages, and a third Wnt activation step to induce proepicardial organ tissues. These steps, carried out in a 96-well format, are highly efficient, reproducible, and produce large amounts of organoids per run. Analysis by immunofluorescence imaging from day 3 to day 11 of differentiation reveals first and second heart field specifications and highly complex tissues inside hHOs at day 15, including myocardial tissue with regions of atrial and ventricular cardiomyocytes, as well as internal chambers lined with endocardial tissue. The organoids also exhibit an intricate vascular network throughout the structure and an external lining of epicardial tissue. From a functional standpoint, hHOs beat robustly and present normal calcium activity as determined by Fluo-4 live imaging. Overall, this protocol constitutes a solid platform for in vitro studies in human organ-like cardiac tissues.

Here, we describe a protocol to create developmentally relevant human heart organoids (hHOs) efficiently using human pluripotent stem cells by self-organization. The protocol relies on the sequential activation of developmental cues and produces highly complex, functionally relevant human heart tissues.

Erzeugung von selbstorganisierenden menschlichen Herzorganoiden aus pluripotenten Stammzellen

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

Biochemie

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

Isolierung und Kultivierung von Avian Embryonale Valvular Progenitorzellen

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Biologie

A Label-free Xenograft Model for Investigating the Behavior of Human Stem Cell Spheroids in Chick Embryos

Xenografts are valuable methods to investigate the behavior of human cells in vivo. In particular, the embryonic environment provides cues for cell migration, differentiation, and morphogenesis, with unique instructive signals and germ layer identity that are often absent from adult xenograft models. In addition, embryonic models cannot discriminate self versus non-self tissues, eliminating the risk of rejection of the graft and the need for immune suppression of the host. This paper presents a methodology for transplantation of spheroids of human cells into chicken embryos, which are accessible, amenable to manipulation, and develop at 37 &#176;C. 
Spheroids allow the selection of a specific region of the embryo for transplantation. After being grafted, the cells become integrated into the host tissue, allowing the follow-up of their migration, growth, and differentiation. This model is flexible enough to allow the utilization of different adherent populations, including heterogeneous primary cell populations and cancer cells. To circumvent the need for prior cell labeling, a protocol for the identification of donor cells through hybridization of human-specific Alu probes is also described, which is particularly important when investigating heterogeneous cell populations. Furthermore, DNA probes can be easily adapted to identify other donor species. This protocol will describe the general methods for preparing spheroids, grafting into chicken embryos, fixing and processing tissue for paraffin sectioning, and finally identifying the human cells using DNA in situ hybridization. Suggested controls, examples of interpretation of results and various cell behaviors that can be assayed will be discussed in addition to the limitations of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>Ein markierungsfreies Xenotransplantat-Modell zur Untersuchung des Verhaltens von menschlichen Stammzell-Sphäroiden in Kükenembryonen

Here, we describe a method to transplant and identify human cell spheroids into chick embryos. This xenograft model uses the embryonic microenvironment as a source of instructive signals to assay cell migration, differentiation, and tropism and is especially suited for the study of primary and/or heterogeneous cell populations.

Ein markierungsfreies Xenotransplantat-Modell zur Untersuchung des Verhaltens von menschlichen Stammzell-Sphäroiden in Kükenembryonen

Xenografts are valuable methods to investigate the behavior of human cells in vivo. In particular, the embryonic environment provides cues for cell ...

Ex-vivo-Kultur von Schlundbögen auf Herz und Muskelvorläuferzellen und ihre Nische Studieren

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung

In - vitro - Kultur von Epikardiale Zellen aus embryonalen Maus - Herz

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

Mikroinjektion basierenden System für In Vivo Implantation von embryonalen Kardiomyozyten des aviären Embryos

In Vitro-Generierung von Mausherzfeldspezifischen Herzvorläuferzellen

Visualisierung und Analyse von Pharyngeal Arch Arterien mittels ganzer Immunhistochemie und 3D-Rekonstruktion

Erzeugung von selbstorganisierenden menschlichen Herzorganoiden aus pluripotenten Stammzellen

Isolierung und Kultivierung von Avian Embryonale Valvular Progenitorzellen

Ein markierungsfreies Xenotransplantat-Modell zur Untersuchung des Verhaltens von menschlichen Stammzell-Sphäroiden in Kükenembryonen

Ein markierungsfreies Xenotransplantat-Modell zur Untersuchung des Verhaltens von menschlichen Stammzell-Sphäroiden in Kükenembryonen