Laserfreies Hydroxylradikalprotein-Footprinting macht die Identifizierung von Proteininteraktionsstellen und Regionen der Bestätigungsveränderung viel einfacher und beschleunigt die Forschung in Proteinaggregations-, Struktur- und Stabilitätsstudien. Mit der Inline-Radikaldosimetrie können Benutzer die effektive Hydroxylradikalbelastung in Echtzeit einstellen, und mit der Echtzeit-Radikaldosimetrie können Sie experimentelle Zeit und wertvolle Proben sparen und gleichzeitig die Reproduzierbarkeit der Markierung verbessern. Um zu beginnen, spalten Sie eine Kieselsäurekapillar mit einem Innendurchmesser von 250 Mikrometern auf 27 Zoll mit einem Kieselsäurespaltenstein und überprüfen Sie die Enden der Kapillare auf einen sauberen und geraden Schnitt.
Erstellen Sie zwei Fenster von etwa 15 Millimetern Länge. Vom unteren Ende der Kapillare brennen Sie die Polyimidbeschichtung 90 Millimeter hoch, um das Photolysefenster und 225 Millimeter für das Dosimeterfenster zu erzeugen. Setzen Sie das untere Ende der Kapillare direkt hinter dem konischen Ende einer Mutter und ferrule ein.
Fügen Sie die Kapillare zu Port fünf hinzu und ziehen Sie sie mit einem Schraubenschlüssel knapp hinter dem Finger fest. Entfernen Sie die Photolyse-Zellkappe des Photolysemoduls, indem Sie sie gerade herausziehen, und entfernen Sie dann die magnetisch montierte Metallmaske, die die Kapillare an Ort und Stelle hält. Öffnen Sie die Dosimeterzelle, indem Sie auf die Lasche auf der linken Seite drücken und die Dosimeterzelle nach rechts öffnen.
Entfernen Sie die magnetisch angebrachten Clips, die die Kapillare an Ort und Stelle halten. Platzieren Sie dann die Kapillare in den gerillten Kanal an der Basis der Photolysezelle und zentrieren Sie das Kapillarfenster mit dem Photolysezellfenster. Halten Sie die Kapillare in Position und fügen Sie die magnetische Maske hinzu.
Setzen Sie die Photolysekappe wieder in Position. Legen Sie die Kapillare in den gerillten Kanal an der Basis der Dosimeterzelle und zentrieren Sie das zweite Kapillarfenster auf der kleinen Öffnung in der Mitte der Dosimeterzelle. Während Sie die Kapillare mit einer Hand in Position halten, platzieren Sie die beiden magnetischen Clips in Position, um die Kapillare an Ort und Stelle zu halten.
Schließen Sie die Dosimeterzelle, bis sie auf Geschlossen klickt. Führen Sie schließlich die Kapillare durch den gerändelten Knopf auf dem Kapillarlift des Produktkollektors ein und verlängern Sie die Kapillare bis knapp über den Boden der Durchstechflasche. Schneiden Sie die gewünschte Länge des Teflonschlauchs mit einem Cutter und überprüfen Sie die Enden auf einen sauberen geraden Schnitt.
Führen Sie ein Ende der neuen Injektionsschlaufe durch eine der Muttern ein und legen Sie eine neue Ferrule auf das Ende des Rohrs. Halten Sie die Mutter und die Ferrule an Ort und Stelle, während Sie das Rohr in Anschluss sechs des Einspritzventils einführen, bis es aus ist. Ziehen Sie die Mutter mit einem Schraubenschlüssel fest und vergewissern Sie sich dann, dass die Mutter und die Ferrule sicher an Ort und Stelle sind.
Sobald beide Enden eine Mutter und eine feste Ferrule haben, schrauben Sie locker ein Ende an Port drei und das andere Ende an Port sechs. Sobald Sie in Position sind, ziehen Sie beide Seiten fest, um den Finger fest zu machen, dann drehen Sie sich ein Viertel mit einem Schraubenschlüssel an den Fingern vorbei. Schalten Sie das laserfreie HRPF-System ein, indem Sie das Fluidikmodul starten, gefolgt von dem Photolysemodul, dem Dosimetermodul, dem Produktkollektor und dem Systemcomputer.
Starten Sie die Systemsoftware. Tauchen Sie den Schlauch vollständig in 10 Milliliter Puffer von der Ventilposition der Spritzenpumpe ein. Leiten Sie den Schlauch von der Abfallposition und den Schlauch von Port zwei auf dem Spritzenhafen in einen leeren Behälter, um Abfälle zu sammeln.
Legen Sie 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen an die Position HN6 auf dem Produktkollektorkarussell. Spülen Sie die Injektionsschleife fünfmal aus, indem Sie 25 Mikroliter HPLC-Wasser mit dem Ventil in die Lastposition einspritzen. Drehen Sie das Einspritzventil manuell, um den Rest des Systems zu spülen.
Wählen Sie in der Steuerungssoftware Prozess aus, um mit dem Fließen von Wasser zu beginnen, bis sich ein Tropfen bildet. Stellen Sie eine Lösung mit zwei millimolaren Adeninen und 10 mikromollen Proteinen vor. Dann machen Sie eine Abschrecklösung mit 0,3 Milligramm pro Milliliter Katalase und 35 Millimolarmethianinamid.
Aliquot 25 Mikroliter Abschrecklösung in eine 200 Mikroliter Mikroröhre. Verdünnen Sie Wasserstoffperoxid auf 200 Millimolar und halten Sie es auf Eis. Starten Sie die Blitzspannung bei null Volt an der Steuerungssoftware.
Diese Null-Volt-Kontrolle bestimmt jede Hintergrundoxidation auf dem interessierenden Protein. Wählen Sie AutoZero starten, gefolgt von Verarbeiten und dann Bereit. Drehen Sie abschließend das Einspritzventil in die Lastposition.
Platzieren Sie die Abschrecklösung in Position eins auf dem Produktkollektorkarussell und wechseln Sie dann die Produktfläschchen in eine auf der Systemsteuerungssoftware. Unmittelbar vor der Injektion 12,5 Mikroliter der Adenin- und Proteinmischung mit 12,5 Mikrolitern Wasserstoffperoxid mischen. Pipetten Sie die Mischung auf und ab, um sie zu mischen, und drehen Sie sie dann schnell herunter.
25 Mikroliter dieser Lösung mit dem Injektionsanschluss innerhalb von 10 Sekunden nach dem Mischen injizieren. Schalten Sie das Einspritzventil in die Injektionsposition und warten Sie, während die Probe verarbeitet wird. Drehen Sie die Blitzspannung an der Steuerungssoftware auf 750 Volt und wiederholen Sie die Beschriftungsschritte.
Notieren Sie dann die Absorption jeder Probe. Klicken Sie zunächst auf Auswählen, und wählen Sie dann manuell den Anfang und das Ende der Spitzenabsorption aus. Geben Sie im verfügbaren Bereich eine Beschreibung des Beispiels ein.
Wiederholen Sie dies für alle erfassten Daten. Kopieren Sie die Daten und fügen Sie sie in eine Tabelle ein, um die durchschnittliche Änderung der Adeninabsorption für jede Spannung zu berechnen. Nachdem alle Proben entnommen wurden, spülen Sie den Spritzenanschluss und die Probenschleife aus, indem Sie das Injektionsventil auf die Lastposition herunterstellen und fünfmal 25 Mikroliter HPLC-Wasser injizieren.
Drehen Sie das Einspritzventil in die Einspritzposition, um den Rest des Systems mit HPLC-Wasser zu spülen. Stoppen Sie nach dem Spülen den Durchfluss, verlassen Sie die Systemsteuerungssoftware und schalten Sie die Module aus, beginnend mit dem Produktkollektor, dem Dosimetermodul, dem Photolysemodul und schließlich dem Fluidikmodul. Nach der Oxidation nimmt das für die Dosimetrie verwendete Adenin die UV-Absorption um 265 Nanometer ab.
Puffer 2 enthält einen Radikalfänger, der die Änderung der Adeninaufnahme im Vergleich zu Puffer 1 verringert. Apomyoglobin wurde in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Adenin bei vier steigenden Plasmalampenspannungen modifiziert. Sechs Peptide wurden nachgewiesen, mit einem linearen Anstieg der Oxidation in Bezug auf die Änderung der Adeninabsorption bei 265 Nanometern.
Diese sechs oxidierten Peptide sind auf einer Kristallstruktur von Myoglobin markiert. Das Ausmaß der Oxidation, das von der Hochdruck-Plasmalampe detektiert wird, ist viel höher als bei der laserbasierten Methode. Dieser Anstieg ergibt sich aus dem breiten UV-Emissionsspektrum der Hochdruck-Plasmalampe.
Durch die Erzeugung eines breiten UV-Spektrums überlappt die Hochdruck-Plasmalampe die Absorptionsdomäne von Wasserstoffperoxid besser, was zu einer effizienteren Produktion von Hydroxylradikalen durch die Photolyse von Wasserstoffperoxid im Vergleich zum Kr F Excimer Laser und Nd YAG Laser führt. Die Hochdruck-Plasmalampe erhöht die Produktion von Hydroxylradikalen signifikant über das hinaus, was typischerweise mit einem Kr F Excimer Laser beobachtet wird. Die Verwendung von 100-Millimolarperoxid kann zu einer hohen Hintergrundoxidation führen.
Wenn das Proteinsystem anfällig für peroxidinduzierte Oxidation ist, verringern Sie die Konzentration auf bis zu 10 Millimolar. Das irreversible Label von HRPF ermöglicht die nachgelagerte Probenhandhabung, einschließlich langer Proteaseaufschlüsse, Sie können Tandem-Massen-Tags für Multiplexing hinzufügen und 2D-Chromatographie durchführen, um die Peptiderkennung und die Konkoordinatenstrukturinformationen zu verbessern.
